エクスビボ マウスの門脈を通る肝臓灌流
Summary
このプロトコルは、門脈灌流による代謝研究のために無傷のマウス肝臓を切除する簡単な方法を記載している。
Abstract
糖尿病、前糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、および非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)などの代謝性疾患は、ますます一般的になりつつある。エクスビボ肝臓灌流は、厳密に制御できる栄養条件下で、核磁気共鳴(NMR)を使用して肝臓代謝の包括的な分析を可能にします。インシリコシミュレーションは、ホルモン作用および薬物介入の効果を評価するための主に理論的手段であり続けているように、灌流肝臓は、肝代謝を理解するための最も貴重な試験床の1つであり続けている。これらの研究は肝生理学への基本的な洞察を導くので、結果は正確で再現性がなければなりません。生体外肝灌流の再現性における最大の要因は、手術の質である。そこで、我々は、in situNMR実験の文脈でエクスビボマウス肝臓灌流を行うための組織的かつ合理化された方法を導入した。また、ユニークなアプリケーションについて説明し、これらの研究で遭遇する一般的な問題についても説明します。全体的な目的は、in situNMR実験の文脈で肝切除および灌流において再現性のある結果を得るためのゴールデンスタンダードと見なす、数年間にわたって洗練されてきた技術への単純なガイドを提供することです。磁石の磁場の中心までの距離と、NMR実験中の介入に対する組織のアクセス不能は、私たちの方法を新規なものにします。
Introduction
生体外灌流は肝代謝の研究において極めて重要であり、門脈を介した灌流はこれらの研究の標準である。単独で肝代謝を研究するためには、肝臓を体内から切除して、他の器官における代謝から生じる合併症(すなわち、全身代謝)を回避し、ホルモンの利用可能性(インスリン、グルカゴンなど)を制御する必要があります。このアプローチは、糖尿病、NAFLD、NASHなどの疾患が肝代謝に及ぼす影響や薬物作用のメカニズムを理解するために不可欠です。この記事は、肝切除と灌流のガイドとして機能します。我々は、これらの代謝肝研究を十分な厳密さと再現性で実施するための合理化された手順を開発しました。手術が正しく行われない場合、得られる代謝データに顕著な変動性がある。我々は、文献1、2、3、4、5に記載されているように、核磁気共鳴(NMR)分光計におけるその場での代謝研究の文脈で門脈カテーテル法および肝臓切除を行うための組織化された方法を説明する。
現在、NMR内のガラスカラムを用いた ex vivo 肝灌流を記載した文献はない。また、マウス肝臓で手順を実行する方法の明確な例を提供するビデオやテキストの出版物、具体的には、門脈をカテーテル法し、肝臓を切除し、肝臓を移し、ガラス柱に吊るす方法を示すものもありません。遺伝子組み換えマウスは肝臓代謝の研究に遍在的に使用されているため、これは完全な説明に値する不可欠な手順です。肝臓灌流手術は新しいものではありませんが、この記事はゴールドスタンダードな方法であり、この手順に関心のあるすべての人を支援するために、このペーパーに記載されている技術的卓越性を示すビデオが添付されています。ここで提示された方法は、疾患モデルにおける代謝産物の機能および代謝回転を検出するために、リアルタイム代謝に最もよく適用されるであろう。
この方法は、NMRチューブ内の灌流液によって封入されたカニューレの底に肝臓を吊るすことを可能にする100cmのウォータージャケット付きガラスカラムを使用する。ガラスジャケット内の加熱された水は、灌流液温度を制御するために使用されます。薄層酸素化器は、pH制御のために95%/5%O2/CO2で加圧される。3つの別々のポンプを使用することにより、灌流液カラムの高さが設定され、肝臓に一定の圧力が供給される。流量は、一定の圧力の印加を超えて制御されません(図1)。肝臓が適切に機能していることを確認するために、酸素測定が流量とともに行われます。私たちの手では、この一連の前提条件は、肝臓代謝機能の評価のための再現性の高いNMR実験につながります。
Protocol
Representative Results
Discussion
この外科的処置は困難であり、再現性のある結果を達成するために広範な練習を必要とする。イソフルランおよびキャリアガスは、できるだけ多くの外科的処置を通して動物の生存率を維持するために、必要に応じて調整されるべきである。環境、時刻、年齢、体重、およびその他のいくつかの要因が麻酔に影響を与えます。体重、食事、マウスの系統、年齢は、脂肪の蓄積が門脈の視覚化?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(R01-DK105346、P41-GM122698、5U2C-DK119889)からの資金提供によって支援された。この研究の一部は、国立科学財団協力協定No.の支援を受けている国立高磁場研究所の先端磁気共鳴イメージングおよび分光法(AMRIS)施設のMcKnight Brain Instituteで行われました。DMR-1644779とフロリダ州。
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- . Medical Dictionary Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022)
- Thorpe, D. R. . A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep’s Brain). , (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- . Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006)
- . Heparin Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022)
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
