アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製

Summary

hisタグの精製、透析、および活性化は、細菌における可溶性で活性なマトリックスメタロプロテイナーゼ-3触媒ドメインタンパク質発現の収率を増加させるために用いられる。タンパク質画分は、SDS-PAGEゲルを介して分析される。

Abstract

マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、細胞外マトリックス(ECM)の分解およびリモデリング、ならびにいくつかの成長因子およびサイトカインとの相互作用において中心的な役割を果たすメチンチンプロテアーゼのファミリーに属する。特定のMMPの過剰発現は、癌、神経変性疾患、および心血管疾患などのいくつかの疾患において責任がある。MMPは、MMPの過剰発現と相関する疾患を治療できる治療法を開発する標的として、近年注目されている。

溶液中のMMPメカニズムを研究するためには、活性で可溶性MMPの生産のために、より容易で堅牢な組換えタンパク質の発現および精製方法が必要である。しかし、ほとんどのMMPの触媒ドメインは、翻訳後機構の欠如のために可溶性形態で 大腸菌 (E. coli)で発現することができないが、哺乳類の発現系は通常高価であり、収率が低い。MMP封入体は、広範な精製およびリフォールディングの退屈で面倒なプロセスを経なければならず、天然の立体構造におけるMMPの収率を著しく低下させる。本稿では、Rosetta2(DE3)pLysS(以下、R2DPという)細胞を用いて、N末端Hisタグとそれに続くプロドメイン(Hisx6-pro-MMP-3cd)を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ-3触媒ドメイン(MMP-3cd)を作製するためのプロトコールを提示する。R2DP細胞は、細菌発現系において通常稀なコドンを含むクロラムフェニコール耐性プラスミドを介して真核生物タンパク質の発現を増強する。組換えタンパク質発現に最適な従来の細胞株BL21(DE3)と比較して、この新しい株を用いた精製により、精製Hisx6-pro-MMP-3cdの収率が向上しました。活性化および脱塩時に、プロドメインはN末端Hisタグとともに切断され、無数の インビトロ用途で 即時使用するための活性MMP-3cdを提供する。この方法は、高価な装置または複雑な融合タンパク質を必要とせず、細菌における組換えヒトMMPの迅速な生産を記載する。

Introduction

ほとんどの複雑な真核生物タンパク質は、発現後に精巧な翻訳後修飾を受け、高度に支援されたタンパク質の折り畳みと補因子が機能的であることを必要とする¹。細菌宿主中で大量の可溶性ヒトタンパク質を生産することは、小規模の実験室実験であっても、高いコストと堅牢な発現および精製方法の欠如のために、依然として大きな課題です^2,3。MMPsは、分子量の大きいヒトエンドペプチダーゼであり、大腸菌で発現すると通常不溶性封入体として発現される。可溶性ヒトMMPの抽出は、しばしば面倒で時間のかかる可溶化およびリフォールディングプロセス^{につながる4}。

MMPは、生理学的および病原性プロセスの両方において重要な役割を果たしている。ヒトMMPは、23個の亜鉛エンドペプチダーゼのファミリーであり、構造および基質特異性によって分類され、高度に保存された触媒ドメインにもかかわらず差動的に発現される^5,6。MMPsは、不活性なザイモゲンとして分泌され、翻訳後活性化およびそれらの内因性阻害剤を介して調節される、メタロプロテイナーゼ(TIMP)の組織阻害剤⁷、^8、9、10。MMPは当初、ECMの代謝回転における役割が認識されていましたが、発生、形態形成、組織修復、およびリモデリングにも関与しています⁸。MMPの調節不全は、神経変性疾患、心臓血管疾患、線維性疾患などとともにがんと顕著に関連しています^5,7。

堅牢な大規模MMP生産法の開発は、生化学的および細胞ベースのアッセイによるMMPメカニズムの将来の研究の成功を確実にするために不可欠です。Hisx6タグ付きMMPを含む様々なMMPが、MMP活性を変化させることなく、細菌¹¹において以前に発現されてきた¹²、13、^14、15。ただし、これらの方法には、複製が困難な退屈で長い手順が含まれます。

哺乳類細胞は、適切な翻訳後修飾を確保しながら、多くの異なるヒトタンパク質を発現させるためにも使用できます¹⁶。哺乳類の発現系は、適切な翻訳後修飾を有する組換えヒトタンパク質を産生するのに理想的な選択であるが、この方法の主な欠点は、初期の低収量、高価な増殖培地および試薬、安定した発現ラインに到達するまでの長いタイムライン、および真菌または細菌などの他の種による汚染のリスクである^2,11。.さらに、哺乳動物細胞株におけるMMP産生は、TIMPまたはフィブロネクチン¹¹などの関連する細胞タンパク質から不純物を生じる。哺乳類細胞で観察される遅い細胞増殖とは異なり、細菌発現系は、より単純な培地および増殖要件とともに、短期間で大規模なタンパク質生産を提供する。しかし、細菌発現系には他の関連する細胞タンパク質(すなわちTIMP)がないため、高濃度の活性MMPは自己タンパク質分解による分解を受け、MMP収率が低下する¹⁷。

本稿では、MMPs2,3,18の手頃な価格、単純さ、およびより高い収率の生産に成功しているため、大腸菌を発現宿主として用いた組換えHisx6-pro-MMP-3cdの細菌発現、精製、および活性化の詳細な方法を説明する^。大腸菌は組換えMMPやその他の複雑なタンパク質に必要なタンパク質折り畳み機構と翻訳後プロセシングを欠いているため、多くの大腸菌株がこれらの制限を克服するように設計されており、大腸菌は組換えヒトMMP-3cdの発現に適した宿主となっています,^19,20。.例えば、本研究で用いたR2DP株は、大腸菌でめったに使用されないコドンを含むクロラムフェニコール耐性プラスミドを供給することにより、真核生物の発現を増強する。

このプロトコールに記載されているように、R2DP細胞においてpET-3aベクター(図1)から比較的純粋な封入体を過剰発現させた後、Hisx6-pro-MMP-3触媒ドメイン(MMP-3cd)タンパク質を抽出し、変性させる⁴。Hisx6-プロ-MMP-3cd3,19をアフィニティータグクロマトグラフィーを用いて精製した。リフォールディングおよび透析時に、プロMMP-3cd(ザイモゲン)を4-アミノフェニル水銀アセテート(APMA)によって活性化し、SDS-PAGE分析を使用して収率およびさらなる精製の必要性を評価する^5,21。このプロトコルは、可溶性MMP-3cdの発現、精製、および活性化を例として記載する。しかしながら、同様の発現、および活性化機構を有する他のMMPsおよびヒトプロテアーゼの発現のためのガイドとしても使用され得る(図2)。MMP-3cd以外の他のタンパク質については、このプロトコールを試みる前に、標的タンパク質に最適なバッファー組成と方法を決定することをお勧めします。

図1:pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cdプラスミドのプラスミドマップ。 このpET-3aベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を含む。N末端Hisx6タグ配列をプロMMP-3cdを含むpET-3aベースのベクターにクローニングし、BamHIとNdeI制限部位との間のT7プロモーターの制御下でpET-3a-Hisx6-プロMMP-3cd構築物を作製する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:プロMMP-3cdの細菌発現、精製、リフォールディング、および活性化 。 1.1:pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cdプラスミドをBL21(DE3)またはR2DP細胞に形質転換した。2:IPTGを用いてPro-MMP-3cdタンパク質発現を誘導した。1.3:化学溶解および超音波処理は、主に不溶性であり、封入体に見られるHisx6-pro-MMP-3cdタンパク質を抽出するために使用されます。尿素は、封入体からタンパク質を変性および可溶化するために使用された。変性Hisx6-pro-MMP-3cdタンパク質をアフィニティークロマトグラフィー精製により精製した。3. 溶出したHisx6-pro-MMP-3cdは、透析中に緩衝液から尿素を徐々に除去することにより、ゆっくりとリフォールディングした。最後に、リフォールディングされたMMP-3cdタンパク質を、N末端プロペプチドドメインを除去することによってAPMAを用いて活性化した。APMAは、後に脱塩によって溶液から除去される。番号は、これらの手順を説明するプロトコルのセクションに対応しています。略語: MMP-3cd = マトリックスメタロプロテイナーゼ-3触媒ドメイン;APMA=4-アミノフェニル水銀アセテート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

1. MMP式 pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cdのR2DP細胞へのクローニングと形質転換 pET-3aプラスミド(材料表を参照)をNdeIおよびBamHI制限酵素で消化バッファー(材料表を参照)で消化します。40 μLの総反応容量に、4 μLの消化バッファー、33 μLの100 ng/μLプラスミド、および1.5 μLの各制限酵素を加え、37°Cで反応が終了するまで約2時間反応を進行させる。 MM…

Representative Results

SDS-PAGE上でサンプルを実行する場合、タンパク質は不溶性封入体の形で発現されるため、溶解および超音波処理された画分は、タンパク質がまだ尿素に再可溶化されていないため、Hisx6-pro-MMP-3cd抽出物をほとんどまたはまったく含まないはずです。 図3 は、BL21(DE3)細胞およびR2DP細胞からのHisx6-pro-MMP-3cdのHis-tag精製溶出画分を比較したものである。溶出画分は、透析前にBL…

Discussion

可溶性、ヒト、組換えMMPの大規模生産は依然として困難な課題である。哺乳類細胞は高いコストと長い待ち時間で機能的なMMPを発現することができますが、大腸菌は精製とリフォールディングが必要な大量のMMP封入体を急速に産生します^11,16。R2DP細胞はMMP封入体の収量を大幅に増加させ、より費用対効果が高く生産的なMMPリフォールディン?…

Materials

0.22 µm sterile filter	Sigma Aldrich	SLGP033RS	Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks	Thermo Fisher Scientific	S76106F	n/a
1 L glass bottles	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 mL microfuge tubes	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G, 1-in. beveled needle	Amazon	B07S7VBHM2	Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column	Thermo Fisher Scientific	89890	Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
250 mL conical bottle cushions	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 mL stirred cell	Sigma Aldrich	UFSC40001	Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube	Sigma Aldrich	UFC901024D	Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI	NEB	R3136S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips	Thermo Fisher Scientific	68011	Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing	Thermo Fisher Scientific	88243	Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer	NEB	B7204S	Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes	Thermo Fisher Scientific	21-200-257	Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix	NEB	E2621S	Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I	NEB	M0303S	Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit	Promega	A9281	Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-500	Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column	BioRad	7321010	Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
Guanidine hydrochloride (GdnHCl)	Thermo Fisher Scientific	AAA135430B	Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.
High-transformation efficiency cells	NEB	C2987	High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer	n/a	n/a	20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	Used to pH buffers
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media	n/a	n/a	To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates	n/a	n/a	To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme	MP Biomedicals	195303	Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit	Promega	A1330	If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI	NEB	R0111S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin	Thermo Fisher Scientific	PI88221	Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
PCR mix	NEB	M0492S	A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid	Addgene	n/a	The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes	VWR	25384-342	Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells	Novagen	714033	BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media	NEB	B9020S	Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate	Thermo Fisher Scientific	PI89905	Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	Detergent used for cell lysis
Urea	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3