Espressione batterica e purificazione della metalloproteinasi-3 della matrice umana mediante cromatografia di affinità

Summary

La purificazione, la dialisi e l’attivazione di His-tag sono impiegate per aumentare le rese di espressione proteica del dominio catalitico solubile e a matrice attiva metalloproteinasi-3 nei batteri. Le frazioni proteiche vengono analizzate tramite gel SDS-PAGE.

Abstract

Le metalloproteinasi della matrice (MMP) appartengono alla famiglia delle proteasi della metzincina con ruoli centrali nella degradazione e nel rimodellamento della matrice extracellulare (ECM), nonché nelle interazioni con diversi fattori di crescita e citochine. La sovraespressione di MMP specifiche è responsabile di diverse malattie come il cancro, le malattie neurodegenerative e le malattie cardiovascolari. Le MMP sono state recentemente al centro dell’attenzione come bersagli per sviluppare terapie in grado di trattare malattie correlate alla sovraespressione di MMP.

Per studiare il meccanismo MMP in soluzione, sono necessari metodi di espressione e purificazione delle proteine ricombinanti più facili e robusti per la produzione di MMP attive e solubili. Tuttavia, il dominio catalitico della maggior parte delle MMP non può essere espresso in Escherichia coli (E. coli) in forma solubile a causa della mancanza di macchinari post-traduzionali, mentre i sistemi di espressione dei mammiferi sono solitamente costosi e hanno rese inferiori. Gli organismi di inclusione MMP devono subire il noioso e laborioso processo di purificazione e ripiegamento estensivo, riducendo significativamente la resa delle MMP in conformazione nativa. Questo documento presenta un protocollo che utilizza le cellule Rosetta2(DE3)pLysS (di seguito denominate R2DP) per produrre il dominio catalitico della metalloproteinasi-3 della matrice (MMP-3cd), che contiene un N-terminal His-tag seguito da pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) da utilizzare nella purificazione dell’affinità. Le cellule R2DP migliorano l’espressione delle proteine eucariotiche attraverso un plasmide resistente al cloramfenicolo contenente codoni normalmente rari nei sistemi di espressione batterica. Rispetto alla tradizionale linea cellulare scelta per l’espressione proteica ricombinante, BL21 (DE3), la purificazione con questo nuovo ceppo ha migliorato la resa di Hisx6-pro-MMP-3cd purificato. Al momento dell’attivazione e della desalinizzazione, il dominio pro viene scisso insieme all’N-terminal His-tag, fornendo MMP-3cd attivo per l’uso immediato in innumerevoli applicazioni in vitro . Questo metodo non richiede attrezzature costose o proteine di fusione complesse e descrive la rapida produzione di MMP umane ricombinanti nei batteri.

Introduction

La maggior parte delle proteine eucariotiche complesse subisce elaborate modificazioni post-traduzionali dopo l’espressione, che richiedono un ripiegamento proteico altamente assistito e co-fattori per essere ^funzionali1. La produzione di grandi quantità di proteine umane solubili in un ospite batterico rimane una sfida significativa a causa dei costi elevati e della mancanza di solidi metodi di espressione e purificazione, anche per esperimenti di laboratorio su scala ^ridotta2,3. Le MMP, endopeptidasi umane con grande peso molecolare, sono solitamente espresse come corpi di inclusione insolubili quando espresse in E. coli. L’estrazione di MMP umane solubili porta spesso a un laborioso e dispendioso processo di solubilizzazione e ripiegamento4.

Le MMP hanno ruoli critici sia nei processi fisiologici che in quelli patogenetici. Le MMP umane sono una famiglia di 23 endopeptidasi di zinco, classificate per struttura e specificità del substrato, ed espresse in modo differenziale nonostante un dominio catalitico altamente ^{conservato5,6}. Le MMP sono secrete come zimogeni inattivi, regolati tramite attivazione post-traduzionale e loro inibitori endogeni, inibitori tissutali delle metalloproteinasi (TIMP)7,8,9,10. Sebbene inizialmente riconosciute per il loro ruolo nel turnover ECM, le MMP sono state anche implicate nello sviluppo, nella morfogenesi, nella riparazione dei tessuti e nel ^{rimodellamento8}. La disregolazione delle MMP è stata in particolare collegata al cancro insieme a malattie neurodegenerative, cardiovascolari e fibrotiche, tra le altre ^malattie5,7.

Lo sviluppo di solidi metodi di produzione MMP su larga scala è fondamentale per garantire il successo di studi futuri sui meccanismi MMP attraverso saggi biochimici e cellulari. Varie MMP sono state precedentemente espresse in ^batteri11, comprese le MMP con tag Hisx6, senza alterare l’attività MMP12,13,14,15. Tuttavia, questi metodi includono passaggi noiosi e lunghi che potrebbero essere difficili da replicare.

Le cellule di mammifero possono anche essere utilizzate per esprimere molte proteine umane diverse, garantendo al contempo le corrette modifiche ^{post-traduzionali16}. Sebbene il sistema di espressione dei mammiferi sia la scelta ideale per produrre proteine umane ricombinanti con adeguate modifiche post-traduzionali, i principali svantaggi di questo metodo sono le basse rese iniziali, i costosi mezzi di crescita e reagenti, le lunghe tempistiche per raggiungere linee di espressione stabili e il rischio di contaminazione con altre specie come funghi o ^batteri2,11 . Inoltre, la produzione di MMP nelle linee cellulari di mammiferi produce impurità da proteine cellulari associate come TIMP o ^{fibronectine11}. A differenza della lenta crescita cellulare osservata nelle cellule di mammifero, il sistema di espressione batterica offre una produzione proteica su larga scala in un breve periodo insieme a mezzi e requisiti di crescita più semplici. Tuttavia, a causa della mancanza di altre proteine cellulari associate (ad esempio, TIMP) nei sistemi di espressione batterica, le MMP attive a concentrazioni più elevate sono soggette a degradazione attraverso l’autoproteolisi, con conseguente scarsa resa ^MMP17.

Questo documento descrive un metodo dettagliato per l’espressione batterica, la purificazione e l’attivazione di Hisx6-pro-MMP-3cd ricombinante utilizzando E. coli come ospite di espressione grazie alla sua convenienza, semplicità e successo nel produrre rese più elevate di MMP2,3,18. Poiché E. coli non ha il meccanismo di ripiegamento delle proteine e l’elaborazione post-traduzionale necessari per le MMP ricombinanti e altre proteine complesse, molti ceppi di E. coli sono stati progettati per superare queste limitazioni, rendendo E. coli un ospite più adatto per l’espressione di MMP-3cd umano ricombinante,19,20 . Ad esempio, il ceppo R2DP utilizzato in questo studio migliora l’espressione eucariotica fornendo un plasmide resistente al cloramfenicolo contenente codoni raramente usati in E. coli.

Come descritto in questo protocollo, dopo la sovraespressione di corpi di inclusione relativamente puri dal vettore pET-3a (Figura 1) nelle cellule R2DP, le proteine del dominio catalitico Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd) vengono estratte e denaturate4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 è stato purificato utilizzando la cromatografia con tag di affinità. Dopo il ripiegamento e la dialisi, il pro-MMP-3cd (zimogeno) è stato attivato dall’acetato di 4-aminofenilmercurio (APMA) e l’analisi SDS-PAGE viene utilizzata per valutare le rese e la necessità di un’ulteriore ^{purificazione5,21}. Questo protocollo descrive l’espressione, la purificazione e l’attivazione di MMP-3cd solubile come esempio. Tuttavia, può anche essere usato come guida per l’espressione di altre MMP e proteasi umane con espressione simile e meccanismi di attivazione (Figura 2). Per altre proteine diverse da MMP-3cd, si consiglia al lettore di determinare le composizioni tampone e i metodi ottimali per la loro proteina bersaglio prima di tentare questo protocollo.

Figura 1: Mappa plasmidica del plasmide pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd. Il vettore pET-3a include un gene di resistenza all’ampicillina. Una sequenza di tag Hisx6 N-terminale viene clonata nel vettore basato su pET-3a, incluso pro-MMP-3cd, per produrre il costrutto pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd sotto il controllo del promotore T7 tra i siti di restrizione BamHI e NdeI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Espressione batterica del plasmide pro-MMP-3cd, purificazione, ripiegamento e attivazione. 1.1: il plasmide pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd è stato trasformato in cellule BL21(DE3) o R2DP. 1.2: L’espressione proteica Pro-MMP-3cd è stata indotta utilizzando IPTG. 1.3: La lisi chimica e la sonicazione vengono utilizzate per estrarre le proteine Hisx6-pro-MMP-3cd che sono principalmente insolubili e si trovano nei corpi di inclusione. L’urea è stata utilizzata per denaturare e solubilizzare le proteine dai corpi di inclusione. 2.1. La proteina Hisx6-pro-MMP-3cd denaturata è stata purificata tramite purificazione cromatografica di affinità. 3. L’Hisx6-pro-MMP-3cd eluito è stato lentamente ripiegato durante la dialisi attraverso la graduale rimozione dell’urea dal tampone. 4. Infine, la proteina MMP-3cd ripiegata è stata attivata utilizzando APMA rimuovendo il dominio pro-peptide N-terminale. L’APMA viene successivamente rimosso dalla soluzione attraverso la desalinizzazione. I numeri corrispondono alle sezioni di protocollo che descrivono questi passaggi. Abbreviazioni: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 catalytic domain; APMA = acetato di 4-aminofenilmercurio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Espressione MMP Clonazione e trasformazione di pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd in celle R2DP Digerire il plasmide pET-3a (vedere la tabella dei materiali) con gli enzimi di restrizione NdeI e BamHI nel digest buffer (vedere la tabella dei materiali). In un volume totale di reazione di 40 μL, aggiungere 4 μL di Digest Buffer, 33 μL di plasmide 100 ng/μL e 1,5 μL di ciascun enzima di restrizione e lasciare che la reazione proceda per ~2 h fino al complet…

Representative Results

Quando si eseguono campioni su SDS-PAGE, poiché la proteina è espressa sotto forma di corpi di inclusione insolubili, le frazioni lisate e sonicate dovrebbero contenere poco o nessun estratto di Hisx6-pro-MMP-3cd, poiché la proteina non è ancora stata risolubilizzata nell’urea. La Figura 3 confronta le frazioni di eluizione di purificazione His-tag di Hisx6-pro-MMP-3cd da celle BL21(DE3) e celle R2DP. Le frazioni di eluizione sono state raggruppate separatamente per entrambe le cellule B…

Discussion

La produzione su larga scala di MMP solubili, umane e ricombinanti rimane un compito impegnativo. Le cellule di mammifero possono esprimere MMP funzionali a costi elevati e lunghi tempi di attesa, mentre E. coli produce rapidamente elevate quantità di corpi di inclusione MMP che devono essere purificati e ripiegati11,16. Le celle R2DP aumentano significativamente la resa degli organismi di inclusione MMP, consentendo un processo di ripiegamento MMP più…

Materials

0.22 µm sterile filter	Sigma Aldrich	SLGP033RS	Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks	Thermo Fisher Scientific	S76106F	n/a
1 L glass bottles	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 mL microfuge tubes	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G, 1-in. beveled needle	Amazon	B07S7VBHM2	Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column	Thermo Fisher Scientific	89890	Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
250 mL conical bottle cushions	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 mL stirred cell	Sigma Aldrich	UFSC40001	Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube	Sigma Aldrich	UFC901024D	Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI	NEB	R3136S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips	Thermo Fisher Scientific	68011	Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing	Thermo Fisher Scientific	88243	Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer	NEB	B7204S	Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes	Thermo Fisher Scientific	21-200-257	Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix	NEB	E2621S	Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I	NEB	M0303S	Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit	Promega	A9281	Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-500	Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column	BioRad	7321010	Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
Guanidine hydrochloride (GdnHCl)	Thermo Fisher Scientific	AAA135430B	Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.
High-transformation efficiency cells	NEB	C2987	High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer	n/a	n/a	20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	Used to pH buffers
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media	n/a	n/a	To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates	n/a	n/a	To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme	MP Biomedicals	195303	Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit	Promega	A1330	If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI	NEB	R0111S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin	Thermo Fisher Scientific	PI88221	Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
PCR mix	NEB	M0492S	A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid	Addgene	n/a	The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes	VWR	25384-342	Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells	Novagen	714033	BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media	NEB	B9020S	Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate	Thermo Fisher Scientific	PI89905	Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	Detergent used for cell lysis
Urea	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3