JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Functionele beoordeling van kinesine-7 CENP-E in spermatocyten met behulp van in vivo remming, immunofluorescentie en flowcytometrie

Published: December 28, 2021
doi:
10.3791/63271
, , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital,Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Summary

Dit artikel meldt een in vivo remming van CENP-E door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK923295, een waardevol model voor mannelijke meiotische deling. Met behulp van de immunofluorescentie, flowcytometrie en transmissie-elektronenmicroscopietests tonen we aan dat CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking en genoominstabiliteit in spermatocyten van muizen.

Abstract

Bij eukaryoten is meiose essentieel voor genoomstabiliteit en genetische diversiteit in seksuele voortplanting. Experimentele analyses van spermatocyten in teelballen zijn van cruciaal belang voor het onderzoek naar spindelassemblage en chromosoomsegregatie bij mannelijke meiotische deling. De spermatocyt van de muis is een ideaal model voor mechanistische studies van meiose, maar de effectieve methoden voor de analyse van spermatocyten ontbreken. In dit artikel wordt een praktische en efficiënte methode beschreven voor de in vivo remming van kinesine-7 CENP-E in spermatocyten van muizen. Een gedetailleerde procedure voor testiculaire injectie van een specifieke remmer GSK923295 door middel van abdominale chirurgie bij 3 weken oude muizen wordt gepresenteerd. Verder wordt hier een reeks protocollen beschreven voor weefselverzameling en -fixatie, hematoxyline-eosinekleuring, immunofluorescentie, flowcytometrie en transmissie-elektronenmicroscopie. Hier presenteren we een in vivo remmingsmodel via buikchirurgie en testiculaire injectie, dat een krachtige techniek zou kunnen zijn om mannelijke meiose te bestuderen. We tonen ook aan dat CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking en metafasestilstand in primaire spermatocyten tijdens meiose I. Onze in vivo remmingsmethode zal mechanistische studies van meiose vergemakkelijken, dienen als een nuttige methode voor genetische modificaties van mannelijke kiembanen en een licht werpen op toekomstige klinische toepassingen.

Introduction

Meiose is een van de belangrijkste, zeer rigide, evolutionair geconserveerde gebeurtenissen in eukaryote organismen en is essentieel voor gametogenese, seksuele voortplanting, genoomintegriteit en genetische diversiteit 1,2,3. Bij zoogdieren ondergaan de geslachtscellen twee opeenvolgende celdelingen, meiose I en II, na een enkele ronde DNA-replicatie. In tegenstelling tot zusterchromatiden bij mitose, paren gedupliceerde homologe chromosomen en scheiden zich in twee dochtercellen tijdens meiose I 4,5. Bij meiose II trekken zusterchromatiden uit elkaar en scheiden zich om haploïde gameten te vormen zonder DNA-replicatie6. Fouten in een van de twee meiotische delingen, waaronder spindelassemblagedefecten en chromosoommissegregatie, kunnen leiden tot het verlies van gameten, steriliteit of aneuploïdiesyndromen 7,8,9.

Accumulerende studies hebben aangetoond dat kinesine-familiemotoren een cruciale rol spelen bij de regulatie van chromosoomuitlijning en -segregatie, spindelassemblage, cytokinese en celcyclusprogressie in zowel mitotische als meiotische cellen10,11,12. Kinesine-7 CENP-E (Centromeer eiwit E) is een plus-end-gerichte kinetochoormotor die nodig is voor chromosoomcongres, chromosoomtransport en -uitlijning, en de regulatie van spindelassemblagecontrolepunt in mitose 13,14,15,16,17,18. Tijdens meiose leidt CENP-E-remming door de specifieke remmer GSK923295 tot celcyclusstilstand, chromosoomafwijking, spindeldesorganisatie en genoominstabiliteit in spermatogene cellen19. De lokalisatiepatronen en dynamiek van CENP-E bij de centromeren van delende spermatocyten geven aan dat CENP-E interageert met kinetochooreiwitten voor de sequentiële assemblage van centromeren tijdens meiose I20,21. In eicellen is CENP-E vereist voor chromosoomuitlijning en de voltooiing van meiose I13,22,23. Antilichamen of morfolino-injectie van CENP-E resulteert in verkeerd uitgelijnde chromosomen, abnormale kinetochoororiëntatie en meiose die ik arresteer in zowel muis- als Drosophila-eicellen 23. Vergeleken met de essentiële rollen van CENP-E bij mitose, blijven de functies en mechanismen van CENP-E in meiose grotendeels onbekend. Gedetailleerde mechanismen van CENP-E in chromosoomcongres en genoomstabiliteit in mannelijke meiotische cellen moeten nog worden opgehelderd.

Spermatogenese is een complex en langdurig fysiologieproces, waarbij sequentiële spermatogoniaproliferatie, meiose en spermiogenese betrokken zijn. Daarom is het hele proces buitengewoon moeilijk om in vitro te worden gereproduceerd bij zoogdieren en andere soorten24,25. Het is onmogelijk om spermatocytendifferentiatie te induceren na het pachyteenstadium in vitro. Studies naar mannelijke meiotische delingen zijn over het algemeen beperkt gebleven tot experimentele analyses van vroege meiotische profase25,26. Ondanks vele technologische inspanningen, waaronder kortetermijncultuur van spermatocyten27,28 en orgaankweekmethoden25, zijn er weinig effectieve methoden om mannelijke meiotische deling te bestuderen. Bovendien resulteert genetische deletie van essentiële genen meestal in ontwikkelingsstilstand en embryonale letaliteit. Muizenembryo’s zonder CENP-E kunnen bijvoorbeeld niet implanteren en kunnen zich niet ontwikkelen na implantatie29, wat een obstakel is in mechanistische studies van CENP-E in meiose. Alles bij elkaar genomen kan het opzetten van een praktisch en haalbaar systeem om mannelijke meiotische deling te bestuderen het onderzoeksveld van meiose aanzienlijk bevorderen.

De kleincellige remmer is een krachtig hulpmiddel om kinesinemotoren in celdeling en ontwikkelingsprocessen te bestuderen. De allosterische remmer, GSK923295, bindt specifiek aan het CENP-E-motordomein, blokkeert de afgifte van ADP (adenosinedifosfaat) en stabiliseert uiteindelijk de interacties tussen CENP-E en microtubuli30. In deze studie wordt een in vivo remmingsmuismodel gepresenteerd door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK923295. CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking in metafase I van primaire spermatocyten. Bovendien leidt CENP-E-remming tot meiotische arrestatie van spermatocyten en de verstoring van spermatogenese. Een reeks protocollen wordt beschreven voor de analyse van spermatocyten en kan worden toegepast om meiotische spindelmicrotubuli, homologe chromosomen en subcellulaire organellen in spermatocyten te observeren. Onze in vivo remmingsmethode is een effectieve methode voor het bestuderen van meiotische deling en spermatogenese.

Protocol

Alle dierproeven werden beoordeeld en goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Fujian Medical University (protocolnummer SYXK 2016-0007). Alle muizenexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen van de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health (NIH-publicaties nummer 8023, herzien 1978). 1. Constructie van GSK923295-gemedieerde CENP-E-remmingsmuismodellen Steriliseer de chirurgisch…

Representative Results

We hebben met succes een in vivo CENP-E-remmingsmodel van muistestikels geconstrueerd door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK92329519. De belangrijkste technische stappen van deze methode zijn weergegeven in figuur 1. Na testiculaire injectie van GSK923295 gedurende 4 dagen werden de teelballen geoogst voor verdere analyses. In de controlegroep was de spermatogene golf in de seminifere tubuli regelmatig en georganiseerd (<strong …

Discussion

In deze studie hebben we een in vivo CENP-E-remmingsmodel van muistestikels opgesteld met behulp van de buikchirurgie en micro-injectie van GSK923295. De abdominale chirurgie en testiculaire injectiemethode die in dit onderzoek wordt gebruikt, heeft de volgende voordelen. Ten eerste is het niet beperkt tot de leeftijd van muizen. Experimentatoren kunnen testiculaire injectie in een vroeg stadium uitvoeren, bijvoorbeeld bij muizen van 3 weken oud of jonger. Ten tweede heeft GSK923295 een specifiek en uitstekend r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken alle leden van het Cytoskeleton Laboratory aan de Fujian Medical University voor nuttige discussies. We bedanken Jun-Jin Lin van het Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor technische assistentie bij flowcytometrie. We bedanken Ming-Xia Wu en Lin-Ying Zhou bij Electron Microscopy Lab van Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor technische assistentie bij elektronenmicroscopie. We bedanken Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke en Jun Song van het Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences aan de Fujian Medical University voor hun steun. Deze studie werd ondersteund door de volgende beurzen: National Natural Science Foundation of China (subsidienummer 82001608), Natural Science Foundation of Fujian Province, China (subsidienummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (subsidienummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (subsidienummer 2017XQ1001), Fujian Medical University high level talents scientific research start-up funding project (subsidienummer XRCZX2017025) en Onderzoeksproject van online onderwijs en onderwijs van afgestudeerde studenten Chinese geneeskunde (beursnummer B-YXC20200202-06).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1 ml Syringe Several commercial brands available Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube Axygen MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody Beyotime AF0001 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody Abcam ab267372 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody Sangon Biotech D110022 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody Abcam ab175191 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides CITOTEST 188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody Beyotime A0423 Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10001060
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 100092690
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II BD Biosciences FACS Canto II
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69003435
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Chloral hydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80037516
Citric acid Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 122670
Collagenase Sangon Biotech A004194-0100
Coverslips CITOTEST 10212020C 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI Beyotime C1006
Dye vat Several commercial brands available 91347802
Eosin Y, alcohol soluble Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71014460
Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009318
Formaldehyde – aqueous solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010018
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
Hematoxylin, anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71020784
ICR mouse Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome Leica EM UC7
Modfit MFLT32 Verity Software House For analysis of flow cytometry results.
Nail polish Several commercial brands available
Neutral gum Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10004160
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Picric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd J60807
Rheodyne Sangon Biotech F519160-0001 10 μl rheodyne
Sliced paraffin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69019461
Sodium iodate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80117214
Surgical instruments Several commercial brands available For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope FEI Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 173970
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30188928 Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30189328 Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80096618
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10023418
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001 (2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson’s Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. 발생학. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. 발생학. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Tags

Keywords: MeiosisSpermatogenesisSpermatocytesCENP-EGSK923295ImmunofluorescenceFlow CytometryGene EditingMouse ModelMicrotome
check_url/kr/63271?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xu, M., Yang, Y., Wei, Y., Zhang, J., Lin, X., Lin, X., Chen, H., She, Z. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image