Valutazione funzionale della kinesina-7 CENP-E negli spermatociti mediante inibizione in vivo , immunofluorescenza e citometria a flusso
Summary
Questo articolo riporta un’inibizione in vivo di CENP-E attraverso la chirurgia addominale e l’iniezione testicolare di GSK923295, un valido modello per la divisione meiotica maschile. Utilizzando i saggi di immunofluorescenza, citometria a flusso e microscopia elettronica a trasmissione, dimostriamo che l’inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico e instabilità del genoma negli spermatociti di topo.
Abstract
Negli eucarioti, la meiosi è essenziale per la stabilità del genoma e la diversità genetica nella riproduzione sessuale. Le analisi sperimentali degli spermatociti nei testicoli sono fondamentali per le indagini sull’assemblaggio del fuso e sulla segregazione cromosomica nella divisione meiotica maschile. Lo spermatocita di topo è un modello ideale per gli studi meccanicistici della meiosi, tuttavia mancano metodi efficaci per l’analisi degli spermatociti. In questo articolo, viene riportato un metodo pratico ed efficiente per l’inibizione in vivo della kinesina-7 CENP-E negli spermatociti di topo. Viene presentata una procedura dettagliata per l’iniezione testicolare di un inibitore specifico GSK923295 attraverso la chirurgia addominale in topi di 3 settimane. Inoltre, qui descritti una serie di protocolli per la raccolta e la fissazione dei tessuti, la colorazione dell’ematossina-eosina, l’immunofluorescenza, la citometria a flusso e la microscopia elettronica a trasmissione. Qui presentiamo un modello di inibizione in vivo tramite chirurgia addominale e iniezione testicolare, che potrebbe essere una tecnica potente per studiare la meiosi maschile. Dimostriamo anche che l’inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico e arresto della metafase negli spermatociti primari durante la meiosi I. Il nostro metodo di inibizione in vivo faciliterà gli studi meccanicistici della meiosi, servirà come metodo utile per le modificazioni genetiche delle linee germinali maschili e farà luce sulle future applicazioni cliniche.
Introduction
La meiosi è uno degli eventi evolutivi evolutivi più importanti, altamente rigidi negli organismi eucariotici, ed è essenziale per la gametogenesi, la riproduzione sessuale, l’integrità del genoma e la diversità genetica 1,2,3. Nei mammiferi, le cellule germinali subiscono due divisioni cellulari successive, meiosi I e II, dopo un singolo ciclo di replicazione del DNA. A differenza dei cromatidi fratelli nella mitosi, i cromosomi omologhi duplicati si accoppiano e si segregano in due cellule figlie durante la meiosi I 4,5. Nella meiosi II, i cromatidi fratelli si separano e si segregano per formare gameti aploidi senza replicazione del DNA6. Errori in una delle due divisioni meiotiche, inclusi difetti di assemblaggio del fuso e missegregazione cromosomica, possono causare la perdita di gameti, sterilità o sindromi aneuploidie 7,8,9.
Studi cumulativi hanno dimostrato che i motori della famiglia delle chinesine svolgono un ruolo cruciale nella regolazione dell’allineamento e della segregazione cromosomica, nell’assemblaggio del fuso, nella citochinesi e nella progressione del ciclo cellulare sia nelle cellule mitotiche che meiotiche10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (proteina Centromero E) è un motore cinetocoro plus-end-directed richiesto per la congressualità cromosomica, il trasporto e l’allineamento cromosomico e la regolazione del checkpoint di assemblaggio del fuso nella mitosi 13,14,15,16,17,18. Durante la meiosi, l’inibizione di CENP-E da parte dell’inibitore specifico porta GSK923295 all’arresto del ciclo cellulare, al disallineamento cromosomico, alla disorganizzazione del fuso e all’instabilità del genoma nelle cellule spermatogeniche19. I modelli di localizzazione e la dinamica di CENP-E nei centromeri degli spermatociti in divisione indicano che CENP-E interagisce con le proteine cinetocore per l’assemblaggio sequenziale dei centromeri durante la meiosi I20,21. Negli ovociti, la CENP-E è necessaria per l’allineamento cromosomico e il completamento della meiosi I13,22,23. L’iniezione di anticorpi o morfolino di CENP-E provoca cromosomi disallineati, orientamento anomalo dei cinetochi e arresto della meiosi I sia negli ovociti di topo che di Drosophila 23. Rispetto ai ruoli essenziali di CENP-E nella mitosi, le funzioni e i meccanismi di CENP-E nella meiosi rimangono in gran parte sconosciuti. I meccanismi dettagliati di CENP-E nel congresso cromosomico e la stabilità del genoma nelle cellule meiotiche maschili devono ancora essere chiariti.
La spermatogenesi è un processo fisiologico complesso e di lunga durata, che coinvolge la proliferazione sequenziale degli spermatogoni, la meiosi e la spermiogenesi. Pertanto, l’intero processo è straordinariamente difficile da riprodurre in vitro nei mammiferi e in altre specie24,25. È impossibile indurre la differenziazione degli spermatociti dopo lo stadio di pachitene in vitro. Gli studi sulle divisioni meiotiche maschili sono stati generalmente limitati ad analisi sperimentali della profase meiotica precoce25,26. Nonostante molti sforzi tecnologici, tra cui la coltura a breve termine degli spermatociti27,28 e i metodi di coltura degli organi25, ci sono pochi metodi efficaci per studiare la divisione meiotica maschile. Inoltre, la delezione genetica di geni essenziali di solito provoca l’arresto dello sviluppo e la letalità embrionale. Ad esempio, gli embrioni di topo privi di CENP-E non riescono a impiantarsi e non possono svilupparsi oltre l’impianto29, che è un ostacolo negli studi meccanicistici di CENP-E nella meiosi. Nel complesso, stabilire un sistema pratico e fattibile per studiare la divisione meiotica maschile può promuovere notevolmente il campo di ricerca della meiosi.
L’inibitore permeabile alle piccole cellule è un potente strumento per studiare i motori della chinesina nella divisione cellulare e nei processi di sviluppo. L’inibitore allosterico, GSK923295, si lega specificamente al dominio motorio CENP-E, blocca il rilascio di ADP (adenosina difosfato) e infine stabilizza le interazioni tra CENP-E e microtubuli30. In questo studio, un modello murino di inibizione in vivo viene presentato attraverso la chirurgia addominale e l’iniezione testicolare di GSK923295. L’inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico nella metafase I degli spermatociti primari. Inoltre, l’inibizione del CENP-E porta all’arresto meiotico degli spermatociti e all’interruzione della spermatogenesi. Una serie di protocolli sono descritti per l’analisi degli spermatociti e possono essere applicati per osservare microtubuli meiotici fuso, cromosomi omologhi e organelli subcellulari negli spermatociti. Il nostro metodo di inibizione in vivo è un metodo efficace per lo studio della divisione meiotica e della spermatogenesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo stabilito un modello di inibizione CENP-E in vivo dei testicoli di topo utilizzando la chirurgia addominale e la microiniezione di GSK923295. La chirurgia addominale e il metodo di iniezione testicolare utilizzati in questo studio presentano i seguenti vantaggi. Innanzitutto, non è limitato all’età dei topi. Gli sperimentatori possono eseguire l’iniezione testicolare in una fase precoce, ad esempio su topi di 3 settimane o più giovani. In secondo luogo, GSK923295 ha un effetto inibit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti i membri del Laboratorio di Citoscheletro presso la Fujian Medical University per le utili discussioni. Ringraziamo Jun-Jin Lin del Public Technology Service Center, Fujian Medical University per l’assistenza tecnica nella citometria a flusso. Ringraziamo Ming-Xia Wu e Lin-Ying Zhou dell’Electron Microscopy Lab del Public Technology Service Center, Fujian Medical University per l’assistenza tecnica nella microscopia elettronica. Ringraziamo Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke e Jun Song del Centro di insegnamento sperimentale di scienze mediche di base presso la Fujian Medical University per il loro supporto. Questo studio è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione 82001608), Natural Science Foundation of Fujian Province, Cina (numero di sovvenzione 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (numero di sovvenzione 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (numero di sovvenzione 2017XQ1001), Fujian Medical University progetto di finanziamento di alto livello per la ricerca scientifica (numero di sovvenzione XRCZX2017025) e Progetto di ricerca di formazione online e insegnamento di studenti laureati in medicina cinese (numero di sovvenzione B-YXC20200202-06).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde – aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
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