Quantification du transport du fer à travers le placenta de la souris in vivo à l’aide d’isotopes de fer non radioactifs
Summary
Cet article montre comment préparer et administrer du fer isotopique non radioactif lié à la transferrine pour des études sur le transport du fer chez la souris gravide. L’approche de quantification du fer isotopique dans les compartiments fœtoplacentaires est également décrite.
Abstract
Le fer est essentiel pour la santé maternelle et fœtale pendant la grossesse, avec environ 1 g de fer nécessaire chez les humains pour maintenir une grossesse en santé. La dotation en fer fœtal dépend entièrement du transfert de fer à travers le placenta, et les perturbations de ce transfert peuvent entraîner des issues défavorables de la grossesse. Chez la souris, la mesure des flux de fer à travers le placenta reposait traditionnellement sur des isotopes de fer radioactifs, une approche très sensible mais lourde. Les isotopes stables du fer (57Fe et 58Fe) offrent une alternative non radioactive pour les études sur la grossesse humaine.
Dans des conditions physiologiques, le fer lié à la transferrine est la forme prédominante de fer absorbée par le placenta. Ainsi, la 58Fe-transferrine a été préparée et injectée par voie intraveineuse chez des mères gravides afin d’évaluer directement le transport du fer placentaire et de contourner l’absorption intestinale du fer maternel en tant que variable confondante. Le fer isotopique a été quantifié dans le placenta et les tissus embryonnaires de souris par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS). Ces méthodes peuvent également être utilisées dans d’autres systèmes de physiologie ou de maladie de modèles animaux pour quantifier la dynamique du fer in vivo .
Introduction
Le fer est essentiel à divers processus métaboliques, notamment la croissance et le développement, la production d’énergie et le transport de l’oxygène1. Le maintien de l’homéostasie du fer est un processus dynamique et coordonné. Le fer est absorbé par les aliments dans le duodénum et transporté dans tout le corps dans la circulation liée à la protéine de transport du fer transferrine (Tf). Il est utilisé par chaque cellule pour les processus enzymatiques, incorporé dans l’hémoglobine dans les érythrocytes naissants et recyclé à partir d’érythrocytes âgés par les macrophages. Le fer est stocké dans le foie lorsqu’il est en excès et perdu du corps par hémorragie ou desquamation cellulaire. La quantité de fer en circulation est le résultat de l’équilibre entre la consommation et l’apport de fer, ce dernier étant étroitement régulé par l’hormone hépatique hepcidine (HAMP), le régulateur central de l’homéostasie du fer1. L’hepcidine a pour fonction de limiter la biodisponibilité du fer dans le sang en occlusant ou en induisant une ubiquitination et en dégradant la ferroportine exportatrice de fer (FPN)2. La réduction de la NPF fonctionnelle entraîne une diminution de l’absorption alimentaire du fer, une séquestration du fer dans le foie et une diminution du recyclage du fer des macrophages1.
L’hepcidine est régulée par le statut en fer, l’inflammation, la pulsion érythropoïétique et la grossesse (revue dans 3). Étant donné que l’homéostasie du fer est très dynamique, il est important de comprendre et de mesurer le pool total de fer et la distribution et le renouvellement du fer. Les études animales reposaient traditionnellement sur des isotopes de fer radioactifs, une approche très sensible mais lourde pour mesurer la dynamique du fer. Cependant, dans des études plus récentes, y compris l’étude présentée ici4, des isotopes de fer stables non radioactifs (58Fe) sont utilisés pour mesurer le transport du fer pendant la grossesse 5,6,7,8,9. Les isotopes stables sont des outils précieux pour étudier le métabolisme des nutriments (examiné dans 10). L’utilisation d’isotopes stables du fer dans les études humaines a démontré que i) l’absorption du fer augmente vers la fin de la gestation5,6, ii) le transfert de fer alimentaire au fœtus dépend du statut en fer de la mère7, iii) le fer hémique ingéré par la mère est plus facilement incorporé par le fœtus que le fer non hémique 8, et iv) le transfert de fer au fœtus est négativement corrélé avec les taux d’hepcidine maternelle 8, 9. Ces expériences ont mesuré les isotopes du fer dans les sérums ou leur incorporation dans les globules rouges; cependant, la mesure du fer incorporé dans les globules rouges peut à elle seule sous-estimer l’absorption réelledu fer 9. Dans la présente étude, le fer hémique et non hémique est mesuré dans les tissus.
Pendant la grossesse, le fer est nécessaire pour soutenir l’expansion du volume de globules rouges maternels et pour le transfert à travers le placenta pour soutenir la croissance et le développement du fœtus11. La dotation en fer fœtal dépend entièrement du transport du fer à travers le placenta. Au cours de la grossesse chez l’homme 12 et le rongeur 4,13, les taux d’hepcidine diminuent considérablement, augmentant la disponibilité plasmatique du fer pour le transfert au fœtus.
Les principes fondamentaux du transport placentaire du fer ont été initialement caractérisés dans les années 1950-70 à l’aide de traceurs radioactifs (59Fe et 55Fe). Ces études ont déterminé que le transport du fer à travers le placenta est unidirectionnel 14,15 et que la transferrine diferrique est une source majeure de fer pour le placenta et le fœtus 16,17. La compréhension actuelle du transport du fer placentaire est plus complète, bien que certains transporteurs de fer clés et mécanismes de régulation restent inconnus. Les modèles murins ont été essentiels pour comprendre la régulation et le transportdu fer 18 parce que les principaux transporteurs et mécanismes sont remarquablement similaires. Les placentas humains et murins sont hémochorials, c’est-à-dire que le sang maternel est en contact direct avec le chorion fœtal19. Cependant, il existe des différences structurelles notables.
Le syncytiotrophoblaste est la couche cellulaire placentaire qui sépare la circulation maternelle et fœtale et transporte activement le fer et d’autres nutriments20. Chez l’homme, le syncytiotrophoblaste est une seule couche de cellules fusionnées. En revanche, le placenta de souris est constitué de deux couches syncytiotrophoblastiques21, Syn-I et Syn-II. Cependant, des jonctions lacunaires à l’interface de Syn-I et Syn-II permettent la diffusion des nutriments entre les couches22,23. Ainsi, ces couches fonctionnent comme une seule couche syncytiale similaire au syncytiotrophoblaste humain. D’autres similitudes et différences entre les placentas humains et murins sont examinées par Rossant et Cross21. Le transport placentaire du fer est déclenché par la liaison du fer-Tf du sang maternel au récepteur de la transferrine (TfR1) localisé sur la face apicale du syncytiotrophoblaste24. Cette interaction induit l’internalisation du fer-Tf/TfR1 via l’endocytose médiée par la clathrine25. Le fer est ensuite libéré de Tf dans l’endosomeacide 26, réduit en fer ferreux par une ferrireductase indéterminée, et exporté de l’endosome vers le cytoplasme par un transporteur qui reste à déterminer. Comment le fer est chaperonné dans le syncytiotrophoblaste reste également à décrire. Le fer est finalement transporté du côté fœtal par l’exportateur de fer, FPN, localisé sur la surface basale ou fœtale du syncytiotrophoblaste (examiné dans27).
Pour comprendre comment la régulation physiologique et pathologique de TfR1, FPN et hepcidine affecte le transport placentaire du fer, des isotopes stables du fer ont été utilisés pour quantifier le transport du fer de la circulation maternelle au placenta et à l’embryon in vivo4. Cet article présente les méthodes de préparation et d’administration de la transférrine de fer isotopique à des souris gravides, le traitement des tissus pour la PCI-MS et le calcul des concentrations de fer dans les tissus. L’utilisation d’isotopes stables du fer in vivo peut être adaptée pour étudier la régulation et la distribution du fer dans différents modèles animaux afin d’étudier la régulation physiologique et pathologique du fer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fer est important pour de nombreux processus biologiques, et son mouvement et sa distribution dans le corps sont très dynamiques et régulés. Les isotopes stables du fer offrent une alternative cohérente et pratique aux isotopes radioactifs pour l’évaluation de la dynamique de l’homéostasie du fer. Une étape critique du protocole consiste à garder une trace de tous les poids et volumes des tissus. Le fer est un élément et ne peut donc pas être synthétisé ni décomposé. Ainsi, si tous les poids et volu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent l’utilisation de l’installation ICP-MS au sein du UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology au CNSI de l’UCLA pour leur aide à optimiser le protocole pour les mesures de 58Fe. L’étude a été soutenue par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) (K01DK127004, à VS) et l’Institut national de la santé infantile et du développement humain (NICHD) des NIH (R01HD096863, à EN).
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
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