Quantificando o transporte de ferro através da placenta de camundongo in vivo usando isótopos de ferro não radioativos
Summary
Este artigo demonstra como preparar e administrar ferro isotópico não radioativo ligado à transferrina para estudos de transporte de ferro na gravidez de camundongos. A abordagem para quantificar o ferro isotópico em compartimentos fetoplacentários também é descrita.
Abstract
O ferro é essencial para a saúde materna e fetal durante a gravidez, com aproximadamente 1 g de ferro necessário em humanos para sustentar uma gravidez saudável. A dotação fetal de ferro é totalmente dependente da transferência de ferro através da placenta, e as perturbações dessa transferência podem levar a resultados adversos na gravidez. Em camundongos, a medição dos fluxos de ferro através da placenta tradicionalmente dependia de isótopos de ferro radioativos, uma abordagem altamente sensível, mas onerosa. Os isótopos estáveis de ferro (57Fe e 58Fe) oferecem uma alternativa não radioativa para uso em estudos de gravidez em humanos.
Sob condições fisiológicas, o ferro ligado à transferrina é a forma predominante de ferro absorvida pela placenta. Assim, 58Fe-transferrina foram preparados e injetados por via intravenosa em mães grávidas para avaliar diretamente o transporte placentário de ferro e contornar a absorção intestinal materna de ferro como uma variável de confusão. O ferro isotópico foi quantificado na placenta e nos tecidos embrionários de camundongos por espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS). Esses métodos também podem ser empregados em outros sistemas de fisiologia ou doença de modelos animais para quantificar a dinâmica do ferro in vivo.
Introduction
O ferro é fundamental para vários processos metabólicos, incluindo crescimento e desenvolvimento, produção de energia e transporte de oxigênio1. A manutenção da homeostase do ferro é um processo dinâmico e coordenado. O ferro é absorvido dos alimentos no duodeno e transportado ao redor do corpo na circulação ligada à transferrina da proteína de transporte de ferro (Tf). É utilizado por todas as células para processos enzimáticos, incorporado à hemoglobina em eritrócitos nascentes e reciclado de eritrócitos envelhecidos por macrófagos. O ferro é armazenado no fígado quando em excesso e perdido do corpo através de hemorragia ou descamação celular. A quantidade de ferro em circulação é o resultado do equilíbrio entre o consumo e o fornecimento de ferro, sendo este último rigidamente regulado pelo hormônio hepcidina (HAMP), regulador central da homeostase do ferro1. A hepcidina funciona para limitar a biodisponibilidade de ferro no sangue, ocluindo ou induzindo ubiquitinação e degradando a ferroportina exportadora de ferro (FPN)2. A redução da NPF funcional leva à diminuição da absorção dietética de ferro, sequestro de ferro no fígado e diminuição da reciclagem de ferro dos macrófagos1.
A hepcidina é regulada pelo estado de ferro, inflamação, impulso eritropoiético e gravidez (revisada em 3). Dado que a homeostase do ferro é altamente dinâmica, é importante entender e medir o pool total de ferro e a distribuição e rotatividade de ferro. Estudos em animais tradicionalmente se baseavam em isótopos de ferro radioativos, uma abordagem altamente sensível, mas onerosa, para medir a dinâmica do ferro. Entretanto, em estudos mais recentes, incluindo o estudo aquiapresentado4, isótopos de ferro estáveis não radioativos (58Fe) são utilizados para medir o transporte de ferro durante a gestação 5,6,7,8,9. Isótopos estáveis são ferramentas valiosas para estudar o metabolismo de nutrientes (revisado em 10). O uso de isótopos estáveis de ferro em estudos em humanos demonstrou que i) a absorção de ferro aumenta no final da gestação5,6, ii) a transferência de ferro dietético para o feto é dependente do status de ferro materno7, iii) o ferro heme ingerido maternalmente é mais prontamente incorporado pelo feto do que o ferro não-heme 8, e iv) a transferência de ferro para o feto está negativamente correlacionada com os níveis maternos de hepcidina 8, 9. Esses experimentos mediram isótopos de ferro em soros ou sua incorporação em hemácias; no entanto, a medida do ferro incorporado isoladamente nas hemácias pode subestimar a verdadeira absorção de ferro9. No presente estudo, tanto o ferro heme quanto o ferro não heme são medidos nos tecidos.
Durante a gravidez, o ferro é necessário para suportar a expansão do volume de glóbulos vermelhos maternos e para a transferência através da placenta para apoiar o crescimento e desenvolvimento do feto11. A dotação fetal de ferro é totalmente dependente do transporte de ferro através da placenta. Durante a gravidez humana 12 e roedor 4,13, os níveis de hepcidina diminuem drasticamente, aumentando a disponibilidade de ferro plasmático para transferência para o feto.
Os fundamentos do transporte placentário de ferro foram inicialmente caracterizados nas décadas de 1950-70 usando traçadores radioativos (59Fe e 55Fe). Esses estudos determinaram que o transporte de ferro através da placenta é unidirecional 14,15 e que a transferrina diférrica é uma importante fonte de ferro para a placenta e o feto 16,17. A compreensão atual do transporte placentário de ferro é mais completa, embora alguns dos principais transportadores de ferro e mecanismos regulatórios permaneçam desconhecidos. Os modelos de camundongos têm sido essenciais para a compreensão da regulação e do transporte de ferro18 porque os principais transportadores e mecanismos são notavelmente semelhantes. Tanto a placenta humana quanto a de camundongo são hemocoriais, ou seja, o sangue materno está em contato direto com o córion fetal19. No entanto, existem algumas diferenças estruturais notáveis.
O sincitiotrofoblasto é a camada celular placentária que separa a circulação materna e fetal e transporta ativamente ferro e outros nutrientes20. Em humanos, o sincitiotrofoblasto é uma única camada de células fundidas. Em contraste, a placenta do rato consiste em duas camadas21 do sinciciotrofoblasto, Syn-I e Syn-II. No entanto, as junções gap na interface do Syn-I e do Syn-II permitem a difusão de nutrientes entre as camadas22,23. Assim, essas camadas funcionam como uma única camada sincicial semelhante ao sinciciotrofoblasto humano. Semelhanças e diferenças adicionais entre placentas humanas e de camundongos são revisadas por Rossant e Cross21. O transporte placentário de ferro é desencadeado pela ligação do ferro-Tf do sangue materno ao receptor de transferrina (TfR1) localizado no lado apical do sincitiotrofoblasto24. Essa interação induz a internalização ferro-Tf/TfR1 via endocitose mediada por clatrina25. O ferro é então liberado da Tf no endossomo ácido26, reduzido a ferro ferroso por uma ferrirredutase indeterminada e exportado do endossomo para o citoplasma por um transportador ainda a ser determinado. Como o ferro é acompanhado dentro do sincitiotrofoblasto também continua a ser descrito. O ferro é eventualmente transportado para o lado fetal pelo exportador de ferro, FPN, localizado na superfície basal ou voltada para o fecho do sincitiotrofoblasto (revisado em27).
Para compreender como a regulação fisiológica e patológica da TfR1, FPN e hepcidina afeta o transporte placentário de ferro, isótopos estáveis de ferro foram utilizados para quantificar o transporte de ferro da circulação materna para a placenta e embrião in vivo4. Este trabalho apresenta os métodos de preparação e administração de transferrina isotópica de ferro em ratas prenhes, processamento de tecidos para ICP-MS e cálculo das concentrações de ferro em tecidos. O uso de isótopos estáveis de ferro in vivo pode ser adaptado para investigar a regulação e distribuição de ferro em diferentes modelos animais para investigar a regulação fisiológica e patológica do ferro.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ferro é importante para muitos processos biológicos, e seu movimento e distribuição dentro do corpo são altamente dinâmicos e regulados. Os isótopos estáveis de ferro fornecem uma alternativa consistente e conveniente aos isótopos radioativos para a avaliação da dinâmica da homeostase do ferro. Um passo crítico no protocolo é manter o controle de todos os pesos e volumes de tecido. O ferro é um elemento e, portanto, não pode ser sintetizado nem quebrado. Assim, se todos os pesos e volumes forem cuidados…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o uso da instalação ICP-MS dentro do Centro de Implicações Ambientais da Nanotecnologia da UC no CNSI da UCLA por sua assistência na otimização do protocolo para medições de 58Fe. O estudo foi apoiado pelo NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, to VS) e pelo NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, to EN).
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
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