Kwantificeren van ijzertransport over de placenta van de muis in vivo met behulp van niet-radioactieve ijzerisotopen
Summary
Dit artikel laat zien hoe transferrinegebonden niet-radioactief isotopisch ijzer kan worden bereid en toegediend voor studies van ijzertransport tijdens de zwangerschap van muizen. De benadering voor het kwantificeren van isotopisch ijzer in foetoplacentale compartimenten wordt ook beschreven.
Abstract
IJzer is essentieel voor de gezondheid van moeders en foetussen tijdens de zwangerschap, met ongeveer 1 g ijzer dat nodig is bij mensen om een gezonde zwangerschap te ondersteunen. Foetale ijzergift is volledig afhankelijk van ijzeroverdracht over de placenta en verstoringen van deze overdracht kunnen leiden tot ongunstige zwangerschapsuitkomsten. Bij muizen was het meten van ijzerfluxen over de placenta traditioneel afhankelijk van radioactieve ijzerisotopen, een zeer gevoelige maar belastende benadering. Stabiele ijzerisotopen (57Fe en 58Fe) bieden een niet-radioactief alternatief voor gebruik in humane zwangerschapsstudies.
Onder fysiologische omstandigheden is transferrinegebonden ijzer de overheersende vorm van ijzer die door de placenta wordt opgenomen. Zo werd 58Fe-transferrine bereid en intraveneus geïnjecteerd in zwangere moederdieren om het placenta-ijzertransport direct te beoordelen en de maternale intestinale ijzerabsorptie als een verstorende variabele te omzeilen. Isotopisch ijzer werd gekwantificeerd in de placenta en embryonale weefsels van de muis door inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS). Deze methoden kunnen ook worden gebruikt in andere diermodelsystemen van fysiologie of ziekte om in vivo ijzerdynamica te kwantificeren.
Introduction
IJzer is van cruciaal belang voor verschillende metabolische processen, waaronder groei en ontwikkeling, energieproductie en zuurstoftransport1. Onderhoud van ijzerhomeostase is een dynamisch, gecoördineerd proces. IJzer wordt geabsorbeerd uit voedsel in de twaalfvingerige darm en getransporteerd rond het lichaam in de circulatie gebonden aan het ijzertransporteiwittransferrine (Tf). Het wordt door elke cel gebruikt voor enzymatische processen, opgenomen in hemoglobine in ontluikende erytrocyten en gerecycled uit verouderde erytrocyten door macrofagen. IJzer wordt opgeslagen in de lever wanneer het in overmaat en verloren gaat uit het lichaam door bloeding of celschilfering. De hoeveelheid ijzer in omloop is het resultaat van de balans tussen de consumptie en de toevoer van ijzer, waarbij de laatste strak wordt gereguleerd door het leverhormoon hepcidine (HAMP), de centrale regulator van ijzerhomeostase1. Hepcidine functioneert om de biologische beschikbaarheid van ijzer in bloed te beperken door ubiquitinatie af te sluiten of te induceren en de ijzerexporteur ferroportine (FPN)2 af te breken. Vermindering van functionele FPN leidt tot verminderde ijzerabsorptie via de voeding, ijzervastlegging in de lever en verminderde ijzerrecycling van macrofagen1.
Hepcidine wordt gereguleerd door ijzerstatus, ontsteking, erytropoëtische drive en zwangerschap (beoordeeld in 3). Aangezien ijzerhomeostase zeer dynamisch is, is het belangrijk om de totale ijzerpool en ijzerdistributie en -omzet te begrijpen en te meten. Dierstudies vertrouwden traditioneel op radioactieve ijzerisotopen, een zeer gevoelige maar belastende benadering om ijzerdynamiek te meten. In meer recente studies, waaronder de hier gepresenteerde studie4, worden niet-radioactieve, stabiele ijzerisotopen (58Fe) echter gebruikt om ijzertransport tijdens de zwangerschap te meten 5,6,7,8,9. Stabiele isotopen zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van het metabolisme van voedingsstoffen (besproken in 10). Het gebruik van stabiele ijzerisotopen in menselijke studies toonde aan dat i) de ijzerabsorptie toeneemt tegen het einde van de zwangerschap 5,6, ii) de overdracht van ijzer in de voeding naar de foetus afhankelijk is van de maternale ijzerstatus7, iii) door de moeder ingenomen heemijzer gemakkelijker door de foetus wordt opgenomen dan niet-restijzer8, en iv) ijzeroverdracht naar de foetus negatief gecorreleerd is met maternale hepcidineniveaus8, 9. Deze experimenten maten ijzerisotopen in sera of hun opname in RBC’s; de meting van ijzer dat alleen in RBC’s is verwerkt, kan echter de werkelijke ijzerabsorptie onderschatten9. In de huidige studie worden zowel heem als nonheme ijzer gemeten in weefsels.
Tijdens de zwangerschap is ijzer nodig om de uitbreiding van het volume van de rode bloedcellen van de moeder te ondersteunen en voor overdracht over de placenta om de groei en ontwikkeling van de foetus te ondersteunen11. Foetale ijzergifte is volledig afhankelijk van ijzertransport over de placenta. Tijdens de zwangerschapvan mens 12 en knaagdier 4,13 nemen de hepcidinespiegels dramatisch af, waardoor de beschikbaarheid van plasmaijzer voor overdracht naar de foetus toeneemt.
De fundamenten van placenta-ijzertransport werden aanvankelijk gekarakteriseerd in de jaren 1950-70 met behulp van radioactieve tracers (59Fe en 55Fe). Deze studies stelden vast dat ijzertransport door de placenta unidirectioneel14,15 is en dat diferric transferrine een belangrijke bron van ijzer is voor de placenta en de foetus16,17. Het huidige begrip van placenta-ijzertransport is completer, hoewel enkele belangrijke ijzertransporters en regulerende mechanismen onbekend blijven. Muismodellen zijn essentieel geweest voor het begrijpen van ijzerregulatie en transport18 omdat de belangrijkste transporters en mechanismen opmerkelijk veel op elkaar lijken. Zowel de placenta van de mens als van de muis zijn hemochoriaal, dat wil zeggen dat het bloed van de moeder in direct contact staat met het foetale chorion19. Er zijn echter enkele opmerkelijke structurele verschillen.
De syncytiotrophoblast is de placentale cellaag die de maternale en foetale circulatie scheidt en actief ijzer en andere voedingsstoffen transporteert20. Bij mensen is de syncytiotrophoblast een enkele laag gefuseerde cellen. De placenta van de muis daarentegen bestaat uit twee syncytiotrophoblastlagen21, Syn-I en Syn-II. Gap junctions op het grensvlak van Syn-I en Syn-II maken echter de diffusie van voedingsstoffen tussen lagen22,23 mogelijk. Deze lagen functioneren dus als een enkele syncytiele laag vergelijkbaar met de menselijke syncytiotrophoblast. Aanvullende overeenkomsten en verschillen tussen menselijke en muis placenta’s worden beoordeeld door Rossant en Cross21. Placentaal ijzertransport wordt geactiveerd door de binding van ijzer-Tf van maternale bloed naar de transferrinereceptor (TfR1) gelokaliseerd aan de apicale kant van de syncytiotrophoblast24. Deze interactie induceert ijzer-Tf/TfR1 internalisatie via clathrin-gemedieerde endocytose25. IJzer wordt vervolgens vrijgegeven uit Tf in het zure endosoom26, gereduceerd tot ijzer door een onbepaald ferrireductase en geëxporteerd van het endosoom naar het cytoplasma door een nog te bepalen transporter. Hoe ijzer wordt gecapitonneerd binnen de syncytiotrophoblast moet ook nog worden beschreven. IJzer wordt uiteindelijk naar de foetale zijde getransporteerd door de ijzerexporteur, FPN, gelokaliseerd op het basale of foetale oppervlak van de syncytiotrophoblast (beoordeeld in27).
Om te begrijpen hoe fysiologische en pathologische regulatie van TfR1, FPN en hepcidine het placentale ijzertransport beïnvloedt, werden stabiele ijzerisotopen gebruikt om ijzertransport van de maternale circulatie naar de placenta en het embryo in vivo te kwantificeren 4. Dit artikel presenteert de methoden voor het bereiden en toedienen van isotopisch ijzertransferrine aan zwangere muizen, het verwerken van weefsels voor ICP-MS en het berekenen van ijzerconcentraties in weefsels. Het gebruik van stabiele ijzerisotopen in vivo kan worden aangepast om ijzerregulatie en -distributie in verschillende diermodellen te onderzoeken om fysiologische en pathologische ijzerregulatie te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
IJzer is belangrijk voor veel biologische processen en de beweging en distributie ervan in het lichaam zijn zeer dynamisch en gereguleerd. Stabiele ijzerisotopen bieden een consistent en handig alternatief voor radioactieve isotopen voor de beoordeling van de dynamiek van ijzerhomeostase. Een cruciale stap in het protocol is het bijhouden van alle weefselgewichten en -volumes. IJzer is een element en kan daarom niet worden gesynthetiseerd of afgebroken. Dus als alle gewichten en volumes zorgvuldig worden geregistreerd, k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen het gebruik van de ICP-MS-faciliteit binnen het UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology in CNSI bij UCLA voor hun hulp bij het optimaliseren van het protocol voor 58Fe-metingen. De studie werd ondersteund door het NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, tot VS) en NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, tot EN).
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
- Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
- Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
- Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
- Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
- Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
- O’Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
- Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
- Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
- Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
- Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, 1567-1574 (2017).
- van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
- Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
- Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
- Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
- Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
- Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
- Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
- Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
- Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport–a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
- Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
- Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
- Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
- Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
- McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
- Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
- Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
- Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
- Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
- Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
- Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).
