Un flux de travail robuste de traitement par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à particule unique avec cryoSPARC, RELION et Scipion
Summary
Cet article explique comment utiliser efficacement trois plates-formes de traitement cryo-EM, à savoir cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3, pour créer un flux de travail unique et robuste applicable à une variété d’ensembles de données monoparticulaires pour la détermination de la structure à haute résolution.
Abstract
Les progrès récents dans les logiciels d’instrumentation et de traitement d’images ont fait de la cryo-microscopie électronique à particule unique (cryo-EM) la méthode préférée des biologistes structuraux pour déterminer les structures à haute résolution d’une grande variété de macromolécules. Plusieurs suites logicielles sont disponibles pour les utilisateurs nouveaux et experts pour le traitement d’image et le calcul de structure, qui rationalisent le même flux de travail de base: les films acquis par les détecteurs de microscope subissent une correction pour l’estimation de la fonction de transfert de mouvement et de contraste induit par faisceau (CTF). Ensuite, les images de particules sont sélectionnées et extraites des images de film moyennées pour une classification itérative 2D et 3D, suivie d’une reconstruction, d’un raffinement et d’une validation 3D. Parce que divers progiciels utilisent des algorithmes différents et nécessitent différents niveaux d’expertise pour fonctionner, les cartes 3D qu’ils génèrent diffèrent souvent en qualité et en résolution. Ainsi, les utilisateurs transfèrent régulièrement des données entre une variété de programmes pour des résultats optimaux. Cet article fournit un guide permettant aux utilisateurs de naviguer dans un flux de travail à travers les progiciels populaires : cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 afin d’obtenir une structure de résolution quasi atomique du virus adéno-associé (AAV). Nous détaillons d’abord un pipeline de traitement d’image avec cryoSPARC v3, car ses algorithmes efficaces et son interface graphique facile à utiliser permettent aux utilisateurs d’arriver rapidement à une carte 3D. Dans l’étape suivante, nous utilisons PyEM et des scripts internes pour convertir et transférer les coordonnées des particules de la meilleure reconstruction 3D obtenue dans cryoSPARC v3 vers RELION-3 et Scipion 3 et recalculer les cartes 3D. Enfin, nous décrivons les étapes à suivre pour affiner et valider davantage les structures résultantes en intégrant les algorithmes de RELION-3 et Scipion 3. Dans cet article, nous décrivons comment utiliser efficacement trois plates-formes de traitement pour créer un flux de travail unique et robuste applicable à une variété d’ensembles de données pour la détermination de la structure haute résolution.
Introduction
La cryo-microscopie électronique (cryo-EM) et l’analyse monoparticulaire (SPA) permettent de déterminer la structure d’une grande variété d’assemblages biomoléculaires à l’état hydraté, contribuant ainsi à éclairer les rôles de ces macromolécules dans les détails atomiques. Les améliorations apportées à l’optique du microscope, au matériel informatique et aux logiciels de traitement d’images ont permis de déterminer les structures des biomolécules à une résolution supérieure à 2 Å1,2,3. Plus de 2 300 structures cryo-EM ont été déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB) en 2020, contre 192 structures en 20144, ce qui indique que la cryo-EM est devenue la méthode de choix pour de nombreux biologistes structuraux. Nous décrivons ici un flux de travail combinant trois programmes SPA différents pour la détermination de la structure à haute résolution (Figure 1).
L’objectif de SPA est de reconstruire les volumes 3D d’un spécimen cible à partir d’images 2D bruyantes enregistrées par un détecteur de microscope. Les détecteurs collectent des images sous forme de films avec des images individuelles du même champ de vision. Afin de préserver l’échantillon, les trames sont collectées avec une faible dose d’électrons et ont donc un faible rapport signal/bruit (SNR). De plus, l’exposition aux électrons peut induire un mouvement dans les grilles cryo-EM vitrifiées, ce qui entraîne un flou de l’image. Pour surmonter ces problèmes, les cadres sont alignés pour corriger le mouvement induit par le faisceau et moyennés pour produire une micrographie avec un SNR accru. Ces micrographies subissent ensuite une estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) pour tenir compte des effets de la mise au point et des aberrations imposées par le microscope. À partir des micrographies corrigées par le CTF, les particules individuelles sont sélectionnées, extraites et triées en moyennes de classe 2D représentant différentes orientations adoptées par l’échantillon dans la glace vitrée. L’ensemble homogène de particules résultant est utilisé comme entrée pour la reconstruction 3D ab initio afin de générer un ou plusieurs modèles grossiers, qui sont ensuite affinés de manière itérative pour produire une ou plusieurs structures à haute résolution. Après la reconstruction, des améliorations structurelles sont effectuées pour améliorer encore la qualité et la résolution de la carte cryo-EM. Enfin, soit un modèle atomique est directement dérivé de la carte, soit la carte est équipée de coordonnées atomiques obtenues ailleurs.
Différents progiciels sont disponibles pour accomplir les tâches décrites ci-dessus, notamment Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 et autres. Bien que ces programmes suivent des étapes de traitement similaires, ils utilisent différents algorithmes, par exemple, pour sélectionner des particules, générer des modèles initiaux et affiner les reconstructions. De plus, ces programmes nécessitent un niveau variable de connaissances et d’intervention de l’utilisateur pour fonctionner, car certains dépendent du réglage fin des paramètres qui peuvent constituer un obstacle pour les nouveaux utilisateurs. Ces écarts se traduisent souvent par des cartes de qualité et de résolution incohérentes sur toutes les plates-formes14, ce qui incite de nombreux chercheurs à utiliser plusieurs progiciels pour affiner et valider les résultats. Dans cet article, nous soulignons l’utilisation de cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 pour obtenir une reconstruction 3D haute résolution de l’AAV, un vecteur largement utilisé pour la thérapie génique15. Les progiciels susmentionnés sont gratuits pour les utilisateurs académiques; cryoSPARC v3 et Scipion 3 nécessitent des licences.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous présentons un flux de travail SPA robuste pour le traitement des données cryo-EM sur diverses plates-formes logicielles afin de réaliser des reconstructions 3D haute résolution (Figure 1). Ce flux de travail est applicable à une grande variété de macromolécules biologiques. Les étapes suivantes du protocole sont décrites à la figure 4, y compris le prétraitement du film, la sélection et la classification des particules, ainsi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Carlos Oscar Sorzano pour son aide à l’installation de Scipion3 et Kilian Schnelle et Arne Moeller pour son aide au transfert de données entre différentes plates-formes de traitement. Une partie de cette recherche a été soutenue par la subvention U24GM129547 des NIH et réalisée au PNCC de l’OHSU et accessible via EMSL (grid.436923.9), une installation d’utilisateurs du DOE Office of Science parrainée par l’Office of Biological and Environmental Research. Cette étude a été soutenue par une subvention de démarrage de l’Université Rutgers à Arek Kulczyk.
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
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