Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion
Summary
Este artigo descreve como utilizar efetivamente três plataformas de processamento crio-EM, ou seja, crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados de partículas únicas para determinação da estrutura de alta resolução.
Abstract
Os recentes avanços no software de instrumentação e processamento de imagens tornaram a microscopia crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) o método preferido para biólogos estruturais determinarem estruturas de alta resolução de uma grande variedade de macromoléculas. Vários pacotes de software estão disponíveis para usuários novos e experientes para processamento de imagens e cálculo de estrutura, que simplificam o mesmo fluxo de trabalho básico: filmes adquiridos pelos detectores de microscópio passam por correção para estimativa da função de transferência de movimento e contraste (CTF) induzida pelo feixe. Em seguida, as imagens de partículas são selecionadas e extraídas de quadros de filme medianos para classificação iterativa 2D e 3D, seguidas de reconstrução 3D, refinamento e validação. Como vários pacotes de software empregam algoritmos diferentes e exigem diferentes níveis de experiência para operar, os mapas 3D que eles geram muitas vezes diferem em qualidade e resolução. Assim, os usuários transferem regularmente dados entre uma variedade de programas para obter resultados ideais. Este artigo fornece um guia para que os usuários naveguem em um fluxo de trabalho através dos pacotes de software populares: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para obter uma estrutura de resolução quase atômica do vírus associado ao adeno (AAV). Primeiro detalhamos um pipeline de processamento de imagem com o crioSPARC v3, pois seus algoritmos eficientes e gui fácil de usar permitem que os usuários cheguem rapidamente a um mapa 3D. Na etapa seguinte, usamos pyem e scripts internos para converter e transferir coordenadas de partículas da melhor reconstrução 3D de qualidade obtida em crioSPARC v3 para RELION-3 e Scipion 3 e recalcular mapas 3D. Finalmente, delineamos etapas para maior refinamento e validação das estruturas resultantes, integrando algoritmos do RELION-3 e Scipion 3. Neste artigo, descrevemos como utilizar efetivamente três plataformas de processamento para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados para determinação de estrutura de alta resolução.
Introduction
A microscopia crio-elétron (crio-EM) e a análise de partículas únicas (SPA) permitem a determinação da estrutura de uma grande variedade de conjuntos biomoleculares em seu estado hidratado, ajudando a iluminar os papéis dessas macromoléculas em detalhes atômicos. Melhorias na óptica de microscópio, hardware de computador e software de processamento de imagens tornaram possível determinar estruturas de biomoléculas em resolução que ultrapassassem 2 Å1,2,3. Mais de 2.300 estruturas crio-EM foram depositadas no Protein Data Bank (PDB) em 2020, em comparação com 192 estruturas em 20144, indicando que o crio-EM tornou-se o método de escolha de muitos biólogos estruturais. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho que combina três programas SPA diferentes para determinação da estrutura de alta resolução (Figura 1).
O objetivo da SPA é reconstruir volumes 3D de um espécime alvo a partir de imagens 2D ruidosas registradas por um detector de microscópio. Os detectores coletam imagens como filmes com quadros individuais do mesmo campo de visão. Para preservar a amostra, os quadros são coletados com uma dose eletrônica baixa e, portanto, têm uma má relação sinal-ruído (SNR). Além disso, a exposição a elétrons pode induzir o movimento dentro das grades crio-EM vitrificadas, resultando em desfoque de imagem. Para superar esses problemas, os quadros estão alinhados para corrigir o movimento induzido pelo feixe e médios para produzir um micrografo com um SNR aumentado. Esses micrografos passam então pela estimativa da Função de Transferência de Contraste (CTF) para explicar os efeitos do desfoco e das aberrações impostas pelo microscópio. A partir dos micrografos corrigidos pelo CTF, as partículas individuais são selecionadas, extraídas e classificadas em médias de classe 2D representando diferentes orientações adotadas pelo espécime em gelo vítreo. O conjunto homogêneo resultante de partículas é usado como entrada para a reconstrução 3D ab iniciado para gerar um modelo ou modelos grosseiros, que são então refinados iterativamente para produzir uma ou mais estruturas de alta resolução. Após a reconstrução, são realizados refinamentos estruturais para melhorar ainda mais a qualidade e a resolução do mapa crio-EM. Finalmente, ou um modelo atômico é diretamente derivado do mapa, ou o mapa é equipado com coordenadas atômicas obtidas em outros lugares.
Diferentes pacotes de software estão disponíveis para realizar as tarefas descritas acima, incluindo Appion5, cisTEM6, crioSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13, entre outros. Embora esses programas sigam etapas semelhantes de processamento, eles empregam diferentes algoritmos, por exemplo, para colher partículas, gerar modelos iniciais e refinar reconstruções. Além disso, esses programas exigem um nível variado de conhecimento e intervenção do usuário para operar, pois alguns dependem do ajuste fino de parâmetros que podem atuar como um obstáculo para novos usuários. Essas discrepâncias geralmente resultam em mapas com qualidade e resolução inconsistentes em todas as plataformas14, levando muitos pesquisadores a usar vários pacotes de software para refinar e validar resultados. Neste artigo, destacamos o uso de crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para obter uma reconstrução 3D de alta resolução do AAV, um vetor amplamente utilizado para terapia genética15. Os pacotes de software acima mencionados são gratuitos para usuários acadêmicos; crioSPARC v3 e Scipion 3 exigem licenças.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, apresentamos um fluxo de trabalho ROBUSTO spa para processamento de dados crio-EM em várias plataformas de software para alcançar reconstruções 3D de alta resolução (Figura 1). Este fluxo de trabalho é aplicável a uma grande variedade de macromoléculas biológicas. As etapas subsequentes do protocolo estão descritas na Figura 4, incluindo pré-processamento de filmes, coleta e classificação de partículas e múltiplos métodos para refi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Carlos Oscar Sorzano pela ajuda na instalação do Scipion3 e kilian Schnelle e Arne Moeller por ajuda na transferência de dados entre diferentes plataformas de processamento. Parte desta pesquisa foi apoiada pela bolsa NIH U24GM129547 e realizada na PNCC da OHSU e acessada através da EMSL (grid.436923.9), um DoE Office of Science User Facility patrocinado pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental. Este estudo foi apoiado por uma bolsa inicial da Universidade Rutgers para Arek Kulczyk.
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
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