乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ
Summary
ここで説明するイントラバイタルイメージング法は、コラーゲンの第二高調波発生と代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光を利用して、標識されていない腫瘍微小環境を腫瘍、間質、血管区画に非侵襲的にセグメント化し、4Dインタビタル内画像の詳細な解析を行います。
Abstract
生きた腫瘍微小環境内の多数の細胞型と細胞外マトリックス(ECM)との間の複雑で動的な生理学的相互作用を視覚化する能力は、腫瘍の進行を調節するメカニズムを理解するための重要なステップである。これは、現在の生体内イメージング技術によって達成することができますが、組織の不均一な性質と実験観察内の空間的文脈の必要性のために、依然として困難です。この目的のために、我々は、コラーゲン第二高調波発生イメージング、代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光、および腫瘍微小環境を腫瘍巣、周囲の間質またはECM、および血管系の基本ドメインに非侵襲的に区画化する手段としての蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)を組み合わせたイントラバイタルイメージングワークフローを開発しました。この非侵襲的プロトコルは、乳腺腫瘍モデルのタイムラプス画像の取得から後処理分析および画像セグメンテーションに至るまで、段階的なプロセスを詳述しています。このワークフローの主な利点は、代謝シグネチャを利用して、外因性蛍光標識を使用せずに動的に変化する生腫瘍微小環境をコンテキスト化することで、ヒト患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび外因性蛍光色素分子が容易に適用できない将来の臨床使用に有利になることである。
Introduction
腫瘍微小環境における細胞外マトリックス(ECM)は、疾患の進行をさらに促進するために、複数の細胞型によって動的に沈着および再構築されることが知られている1、2、3。これらのマトリックス変化は、細胞挙動を変化させる機械的および生物学的手がかりの両方を提供し、しばしばマトリックスリモデリングの継続的なサイクルをもたらす4。腫瘍細胞と細胞外マトリックスとの間の動的で相互的な相互作用の調査は、しばしば三次元(3D)体外培養またはマイクロ流体系を用いて行われる。これらのボトムアップアプローチはECMリモデリング5、6、7、増殖の増加8、上皮から間葉への移行9、10、11、12、および腫瘍細胞遊走および浸潤7、13、14、15、16のメカニズムを実証している。それらの焦点は、生理学的組織内に存在する相互作用の多様性および不均一性と比較して、均質な3Dマトリックス内のいくつかの細胞型(例えば、腫瘍細胞または線維芽細胞)に主に焦点を当ててきた。インビトロ系に加えて、エキソビボ腫瘍組織学はまた、これらの細胞間および細胞−ECM相互作用に関するいくつかの洞察を提供することができる17。免疫組織化学は、ECMの空間的に不均一な組成およびアーキテクチャに関して複数の細胞型を分析できるという利点を有するが、固定組織の静的エンドポイントは、細胞と微小環境との間の相互作用の動的性質を捕捉しない。イントラバイタルイメージングは、ネイティブの腫瘍微小環境の生理学的文脈における多様で動的な相互作用を調査する扉を開きました。
生体内腫瘍イメージングの能力は急速に進歩しています。画像化窓の設計および窓を移植するための外科的技術の改善により、様々な解剖学的位置(すなわち、原発性腫瘍、リンパ節、転移部位)における長期縦断的腫瘍画像化が可能になった18、19、20。さらに、複数の次元(スペクトル、空間蛍光強度、および寿命)で、高解像度および速度(ビデオレート)でデータを視覚化および収集する光学機器の能力は、広くアクセス可能になりつつある。改良された技術は、生理学的環境における細胞シグナル伝達および表現型ダイナミクスの急速な変化を探求する機会を提供する。最後に、光遺伝学的ツールの拡大および広範囲の遺伝的蛍光構築物は、特定の細胞型のタグ付けを可能にし、発生または疾患進行中の腫瘍微小環境または細胞系譜トレースにおける細胞遊走を捕捉する21、22。これらのツールをCRISPR/Cas9技術と組み合わせて使用することで、研究者はユニークな動物モデルをタイムリーに生成することができます。
これらすべての進歩により、生体内イメージングは動的および生理学的細胞相互作用を探求するためのますます強力な方法となっていますが、これらの生物学的相互作用に組織レベルで空間的、時間的、および構造的文脈を提供する戦略を開発することが依然として重要です。現在、多くの生体内イメージング研究は、血管系に蛍光色素を注入するか、または外因的に蛍光タンパク質を発現して身体的特徴を描写するマウスモデルを使用することによって、血管などの視覚的ランドマークの欠如を補っている。注射可能な色素および蛍光デキストランのような基質は、生体内コレクション19、 23、 24において血管系を首尾よく標識するために広く利用されている。ただし、このアプローチには制限がないわけではありません。1つは、追加のマウス操作が必要であり、その有用性は短期的な実験に限定されています。縦断的研究の場合、蛍光デキストランは、貪食細胞におけるデキストランの蓄積または経時的な周囲の組織への拡散を観察するにつれて問題となり得る25。マウスモデルへの外因性蛍光タンパク質の取り込みは、蛍光デキストランの代替として提示されているが、それ自体の限界を提示している。マウスモデル内の外因性蛍光色素の入手可能性と多様性は、依然として限られており、作成にコストがかかります。さらに、PDXモデルなどの特定のモデルでは、遺伝子操作は望ましくなく、不可能です。また、細胞内の蛍光または生物発光タンパク質の存在は、マウス内で、および免疫担当マウスモデル内で異物として認識され、これは宿主免疫系の応答に起因する転移の量を減少させることも示されている26、27。最後に、空間的文脈または後続のデータをセグメント化するために使用される外因性蛍光タンパク質または蛍光色素は、しばしば、目的の生理学的相互作用を調査するために使用され得る光スペクトルのプライム範囲を占める。
ECMからの固有のシグナルまたは組織内の細胞からの内因性蛍光の使用は、より詳細な細胞および空間分析のためにバイタル内データをセグメント化する潜在的な普遍的なラベルフリー手段を表す。第2高調波発生(SHG)は、ECM28を視覚化するために長い間使用されてきた。繊維組織29、30、31の特性評価を支援するための重要なツールのその後の開発により、局所ECM構造に対する細胞挙動を特徴付けることができる。さらに、内因性代謝産物であるNAD(P)Hからの自家蛍光は、インビボで腫瘍微小環境を区画化するための別の標識のないツールを提供する。NAD(P)Hは腫瘍細胞内で明るく蛍光を発し、成長している腫瘍巣の境界を周囲の間質から区別するために使用することができる21,32。最後に、血管系は、腫瘍微小環境および重要な細胞型特異的相互作用の部位において重要な生理学的構造である33、34、35。赤血球(RBC)または血漿の励起は、腫瘍血管系を視覚化するために使用され、2光子または3光子励起(2P;)を使用して、血流速度の測定が可能であることが示されている36。しかし、大きな血管は内因性の蛍光シグネチャによって容易に識別できますが、微妙で可変で蛍光性の低い小さな血管の同定には、より多くの専門知識が必要です。これらの固有の困難は、最適な画像セグメンテーションを妨げます。幸いなことに、これらの内因性蛍光源(すなわち、赤血球および血漿)は、血管系のユニークな光物理的特性を利用し、成長する生命内ツールボックスへの有用な付加物を表す蛍光寿命画像化37によっても測定することができる。
このプロトコルでは、内因性蛍光やSHGなどの固有のシグナルを使用して、4次元(4D)イントラバイタルイメージングのセグメンテーションを明示的に行うためのワークフローが、取得から解析まで記述されています。このプロトコルは、PDXモデルの場合のように、外因性蛍光が実用的または不可能である可能性がある乳房イメージングウィンドウを介した縦断的研究に特に適切である。しかし、ここで概説したセグメンテーションの原則は、腫瘍生物学、組織発生、さらには正常な組織生理学を調査する生体内ユーザーに広く適用できます。報告された一連の分析アプローチにより、ユーザーは、整列またはランダムなコラーゲン線維構成の領域間で細胞挙動を区別し、腫瘍微小環境の特定の領域に存在する細胞の数または挙動を比較し、ラベルフリーまたは内因性シグナルのみを使用して血管系を腫瘍微小環境にマッピングすることができる。これらの方法を組み合わせることで、乳腺の4Dイントラバイタルイメージングから得られる情報の深さを最大化し、追加の外因性ラベルの必要性を最小限に抑えるための運用フレームワークが作成されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
4Dイントラバイタルイメージングは、ネイティブの腫瘍微小環境の空間的および時間的コンテキスト内の動的な生理学的相互作用を調査するための強力なツールです。この原稿は、第2高調波発生またはNAD(P)H自己蛍光からの内因性信号のみを使用して、腫瘍塊、隣接する間質、または血管網に近接した範囲内の動的細胞相互作用を区画化するための非常に基本的で適応可能な運用フレームワー…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この研究に資金を提供したNCI R01 CA216248、CA206458、およびCA179556助成金に感謝したい。また、ケビン・エリセイリ博士と彼のイメージンググループが、私たちのイントラバイタルプログラムの早期開発における技術的専門知識に感謝したいと思います。我々はまた、ベン・コックス博士及びモーグリッジ研究所のエリセイリ・ファブリケーション・グループの他のメンバーに対し、MIWの初期段階における本質的な技術設計に感謝する。エレン・ドブソン博士は、ImageJ トレーニング可能な WEKA セグメンテーション ツールに関する有益な会話を支援しました。さらに、メリッサ・スカラ博士とアレクサ・バレス・ヒートン博士の顕微鏡のタイムリーな使用に感謝します。最後に、D.V.M.のBrigitte Raabe博士に、マウスの取り扱いとケアに関するすべての思慮深い議論とアドバイスに感謝します。
Materials
| #1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
| 1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
| 20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
| 27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
| 40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
| 5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
| Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
| Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
| cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
| fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
| forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
| GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
| heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
| heating chamber | home built | ||
| Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
| inverted microscope base | Nikon | ||
| Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
| Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
| Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
| multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
| NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
| Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
| objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
| SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
| Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
| SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
| surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
| surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
| Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
| TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
| Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
| two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
| ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
| Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |
References
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
- Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
- Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
- Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
- Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
- Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
- Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
- Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. 암 연구학. 70 (11), 4327-4334 (2010).
- Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
- Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
- Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
- Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
- Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
- Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
- Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
- Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
- Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. 암 연구학. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
- Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
- Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
- Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
- Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), 925-938 (2013).
- Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
- You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
- Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
- Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
- Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
- Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
- Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
- Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
- Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
