Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

Summary

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Abstract

A capacidade de visualizar interações fisiológicas complexas e dinâmicas entre numerosos tipos de células e a matriz extracelular (ECM) dentro de um microambiente tumoral vivo é um passo importante para entender mecanismos que regulam a progressão do tumor. Embora isso possa ser realizado através das técnicas atuais de imagem intravital, ela permanece desafiadora devido à natureza heterogênea dos tecidos e à necessidade de contexto espacial dentro da observação experimental. Para isso, desenvolvemos um fluxo de trabalho de imagem intravital que emparelha a imagem de segunda geração harmônica de colágeno, fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H, e microscopia de imagem de fluorescência vitalícia (FLIM) como meio de compartimentar não invasivamente o microambiente tumoral do tumor em domínios básicos do ninho tumoral, o estroma circundante ou ECM, e a vaculatura. Este protocolo não invasivo detalha o processo passo a passo que vai desde a aquisição de imagens de lapso de tempo de modelos de tumores mamários até análise pós-processamento e segmentação de imagens. A principal vantagem deste fluxo de trabalho é que ele explora assinaturas metabólicas para contextualizar o microambiente tumoral vivo em mudança dinâmica sem o uso de rótulos fluorescentes exógenos, tornando-o vantajoso para modelos de xenerto derivados do paciente humano (PDX) e uso clínico futuro onde fluoroforos extrínsecos não são prontamente aplicáveis.

Introduction

A matriz extracelular (ECM) no microambiente tumoral é conhecida por ser dinamicamente depositada e remodelada por múltiplos tipos de células para facilitar ainda mais a progressão da doença ^1,2,3. Essas alterações matriciais fornecem sinais mecânicos e biológicos que alteram o comportamento celular e muitas vezes resultam em um ciclo contínuo de remodelação matricial⁴. A investigação sobre a interação dinâmica e recíproca entre as células tumorais e a matriz extracelular é frequentemente conduzida usando cultura tridimensional (3D) in vitro ou sistemas microfluidos. Embora essas abordagens de baixo para cima tenham demonstrado mecanismos de remodelação do ECM ^5,6,7, aumento da proliferação⁸, epitelial para transição mesenquimal ^9,10,11,12, e migração e invasão de células tumorais 7,13,14,15,16 , seu foco tem sido principalmente em alguns tipos de células (por exemplo, células tumorais ou fibroblastos) dentro de uma matriz 3D homogênea em comparação com a diversidade e heterogeneidade das interações presentes dentro de um tecido fisiológico. Além dos sistemas in vitro, a histologia tumoral ex vivo também pode fornecer algumas informações sobre essas interações célula-célula e célula-ECM¹⁷. A imunohistoquímica tem a vantagem de poder analisar múltiplos tipos celulares no que diz respeito à composição espacialmente heterogênea e arquitetura do ECM, mas os pontos finais estáticos do tecido fixo não captam a natureza dinâmica das interações entre as células e o microambiente. A imagem intravital abriu a porta para interrogar interações diversas e dinâmicas dentro do contexto fisiológico do microambiente tumoral nativo.

As capacidades de imagem de tumor intravital estão avançando rapidamente. Melhorias no design de janelas de imagem e técnicas cirúrgicas para implantar as janelas permitiram imagens longitudinais de tumor a longo prazo em uma variedade de locais anatômicos (ou seja, tumor primário, linfonodos, sítios metastáticos 18,19,20). Além disso, a capacidade de instrumentação óptica para visualizar e coletar dados em múltiplas dimensões (ou seja, intensidade espectral, fluorescência espacial e vida útil), e em alta resolução e velocidade (taxa de vídeo) está se tornando amplamente acessível. A tecnologia aprimorada oferece uma oportunidade para explorar mudanças rápidas na sinalização celular e dinâmica fenotípica dentro de um ambiente fisiológico. Por fim, a expansão das ferramentas optogenéticas e a ampla gama de construções fluorescentes genéticas permitem a marcação de tipos celulares específicos para capturar a migração celular no microambiente tumoral ou rastreamento de linhagem celular durante o desenvolvimento ou progressão da doença^21,22. O uso dessas ferramentas em combinação com a tecnologia CRISPR/Cas9 proporciona aos pesquisadores a oportunidade de gerar modelos animais únicos em tempo hábil.

Embora todos esses avanços tornem a imagem intravital um método cada vez mais poderoso para explorar interações celulares dinâmicas e fisiológicas, ainda há uma necessidade importante de desenvolver estratégias que forneçam contexto espacial, temporal e estrutural no nível tecidual a essas interações biológicas. Atualmente, muitos estudos de imagem intravital compensam a falta de marcos visuais, como os vasos sanguíneos, injetando corantes fluorescentes na vasculatura ou empregando modelos de camundongos que exógenos expressam proteínas fluorescentes para delinear características físicas. Corantes injetáveis e substratos como dextrans fluorescentes são amplamente utilizados para rotular com sucesso a vasculatura nas coleções intravitais^{19, 23, 24}. No entanto, essa abordagem não é sem limitações. Por um tempo, requer manipulações adicionais de mouse e sua utilidade está limitada a experimentos de curto prazo. Para estudos longitudinais, o dextran fluorescente pode ser problemático, pois observamos o acúmulo de dextran em células fagocíticas ou difusão no tecido circundante ao longo do tempo²⁵. A incorporação de proteínas fluorescentes exógenas no modelo do camundongo tem sido apresentada como uma alternativa aos dextrans fluorescentes, mas apresenta limitações próprias. A disponibilidade e a diversidade de fluoroforos exógenos dentro dos modelos de mouse ainda são limitadas e caras de criar. Além disso, em modelos específicos, como modelos PDX, manipulações genéticas não são desejáveis ou possíveis. Também foi demonstrado que a presença de proteínas fluorescentes ou bioluminescentes dentro das células são reconhecidas como estrangeiras dentro do camundongo, e dentro de modelos de camundongos imunocompetuntes, isso reduz a quantidade de metástase devido à resposta do sistema imunológico hospedeiro^26,27. Por fim, proteínas fluorescentes exógenas ou corantes fluorescentes usados para contexto espacial ou para segmentar dados subsequentes muitas vezes ocupam faixas primos do espectro de luz que poderiam ser usadas para investigar as interações fisiológicas de interesse.

O uso do sinal intrínseco do ECM ou fluorescência endógena das células dentro do tecido representa um potencial meio universal livre de rótulos para segmentar dados intravitais para uma análise celular e espacial mais aprofundada. A segunda geração harmônica (SHG) tem sido usada há muito tempo para visualizar o ECM²⁸. Com o desenvolvimento subsequente de importantes ferramentas para auxiliar na caracterização da organização de^fibras 29,30,31, é possível caracterizar o comportamento celular em relação à estrutura local de ECM. Além disso, a autofluorescência do metabólito endógeno, NAD(P)H, fornece outra ferramenta sem rótulos para compartimentar o microambiente tumoral in vivo. Nad(P)H fluoresce brilhantemente em células tumorais e pode ser usado para discriminar os limites do ninho tumoral em crescimento de seu estroma circundante^21,32. Por fim, a vasculatura é uma importante estrutura fisiológica no microambiente tumoral e local de interações específicas do tipo celular chave 33,34,35. A excitação dos glóbulos vermelhos (RBC) ou plasma sanguíneo tem sido usada para visualizar a vasculatura tumoral, e usando excitação de dois ou três fótons (2P; 3P) a medição das taxas de fluxo sanguíneo tem se mostrado possível³⁶. No entanto, enquanto os vasos sanguíneos maiores são facilmente identificáveis por suas assinaturas de fluorescência endógena, a identificação de vasos sanguíneos pequenos sutis, variáveis e menos fluorescentes requer mais conhecimento. Essas dificuldades inerentes dificultam a segmentação de imagem ideal. Felizmente, essas fontes de fluorescência endógena (ou seja, glóbulos vermelhos e plasma de sangue) também podem ser medidas pela imagem de vida fluorescência³⁷, que capitaliza as propriedades fotofísicas únicas da vasculatura e representa uma adição útil à crescente caixa de ferramentas intravital.

Neste protocolo, um fluxo de trabalho para a segmentação de imagens intravitais quadridimensionais (4D) explicitamente utilizando sinais intrínsecos como fluorescência endógena e SHG é descrito desde a aquisição até a análise. Este protocolo é particularmente pertinente para estudos longitudinais através de uma janela de imagem mamária onde a fluorescência exógena pode não ser prática ou possível, como é o caso dos modelos PDX. Os princípios de segmentação aqui descritos, no entanto, são amplamente aplicáveis aos usuários intravitais que investigam biologia tumoral, desenvolvimento de tecidos ou mesmo fisiologia tecidual normal. O conjunto de abordagens de análise relatadas permitirá aos usuários diferenciar o comportamento celular entre regiões de configurações alinhadas ou aleatórias de fibra de colágeno, comparar números ou comportamentos de células residentes em regiões específicas do microambiente tumoral e mapear a vasculatura para o microambiente tumoral usando apenas sinal livre de rótulos ou intrínsecos. Juntos, esses métodos criam uma estrutura operacional para maximizar a profundidade das informações obtidas a partir da imagem intravital 4D da glândula mamária, minimizando a necessidade de rótulos exógenos adicionais.

Protocol

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison. O bem-estar e o tratamento da dor em todos os experimentos com animais é primordial. Assim, todos os esforços são feitos para garantir que o animal esteja confortável e bem cuidado em cada etapa do procedimento. 1. Geração da janela de imagem mamária (MIW) Para construir a janela de imagem mamária, forja um anel de 14 m…

Representative Results

A instalação do MIW e o planejamento experimental básico são os primeiros passos nesse processo. Este projeto e protocolo MIW em particular são mais favoráveis aos estudos longitudinais19 e tem sido utilizado com sucesso com microscópios eretos e invertidos. Neste caso, um microscópio invertido foi usado, pois resultou em maior estabilidade de imagem da glândula mamária com menos artefatos respiratórios. Na Figura 1A, fornecemos as dimensões do MIW rígido…

Discussion

A imagem intravital 4D é uma ferramenta poderosa para investigar interações fisiológicas dinâmicas dentro do contexto espacial e temporal do microambiente tumoral nativo. Este manuscrito fornece uma estrutura operacional muito básica e adaptável para compartimentar interações celulares dinâmicas dentro da massa tumoral, do estroma adjacente ou nas proximidades da rede vascular usando apenas sinais endógenos de segunda geração harmônica ou autofluorescência NAD(P)H). Este protocolo fornece um método abrang…

Materials

#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF