Aproveitando a microtomografia computadorizada para analisar interações parasitas planta-hospedeiro

Summary

A micro-TC é uma ferramenta não destrutiva capaz de analisar as estruturas das plantas em três dimensões. O presente protocolo descreve o preparo da amostra para alavancar micro-CT para analisar a estrutura e função de plantas parasitas. Diferentes espécies são utilizadas para destacar as vantagens deste método quando associado a preparações específicas.

Abstract

A micro-TC tornou-se uma ferramenta estabelecida na investigação da estrutura e função da planta. Sua natureza não destrutiva, combinada com a possibilidade de visualização tridimensional e seccionamento virtual, tem permitido novas e cada vez mais detalhadas análises de órgãos vegetais complexos. Interações entre plantas, inclusive entre plantas parasitas e seus hospedeiros, também podem ser exploradas. No entanto, o preparo da amostra antes da digitalização torna-se crucial devido à interação entre essas plantas, que muitas vezes diferem na organização e composição dos tecidos. Além disso, a ampla diversidade de plantas com flores parasitas, desde corpos vegetativos altamente reduzidos até árvores, ervas e arbustos, deve ser considerada durante a amostragem, tratamento e preparação do material parasita-hospedeiro. Aqui duas abordagens diferentes são descritas para a introdução de soluções de contraste no parasita e/ou plantas hospedeiras, com foco na análise do haustório. Este órgão promove a conexão e comunicação entre as duas plantas. Seguindo uma abordagem simples, detalhes da organização do tecido haustório podem ser explorados tridimensionalmente, como mostrado aqui para espécies parasitas eufitóides, videiras e visco. A seleção de agentes contrastantes específicos e as abordagens de aplicação também permitem a observação detalhada da disseminação do endoparasita dentro do corpo do hospedeiro e a detecção da conexão direta vaso-vaso entre o parasita e o hospedeiro, como mostrado aqui para um parasita radicular obrigatório. Assim, o protocolo aqui discutido pode ser aplicado à ampla diversidade de plantas com flores parasitas para avançar na compreensão de seu desenvolvimento, estrutura e funcionamento.

Introduction

A microtomografia computadorizada de alta resolução (micro-TC) é um método de imagem no qual múltiplas radiografias (projeções) de uma amostra são registradas a partir de diferentes ângulos de visão e, posteriormente, utilizadas para proporcionar uma reconstrução virtual da amostra¹. Esse objeto virtual pode então ser analisado, manipulado e segmentado, permitindo uma exploração não destrutiva em três dimensões². Inicialmente projetada para análises médicas e posteriormente para aplicações industriais, a micro-TC também oferece a vantagem de visualizar órgãos e tecidos internos sem a necessidade de procedimentos invasivos³. Como outras formas de imagem, a micro-TC trabalha com um trade-off entre o campo de visão e o tamanho do pixel, o que significa que imagens de alta resolução de grandes amostras são quase inatingíveis⁴. Avanços no uso de fontes de raios X de alta energia (síncrotron) e ampliação óptica secundária estão sendo constantes, permitindo que a menor resolução chegue abaixo de 100 nm ^5,6. No entanto, tempos de varredura mais longos são necessários para amostras grandes, aumentando a chance de artefatos devido à movimentação ou deformação da amostra dentro do scanner. Além disso, a micro-TC é geralmente limitada por variações de densidade natural dentro da amostra e como a amostra interage com os raios-X. Embora uma dose maior de raios X seja melhor para penetrar amostras mais densas, ela é menos eficiente em capturar variações de densidade dentro e entre a amostra e seu meio circundante⁷. Por outro lado, uma menor dose de raios X oferece menor poder de penetração e, muitas vezes, requer tempos de varredura mais longos, mas maior sensibilidade na detecção de densidade⁷.

Essas restrições há muito dificultam o uso da microtomografia para as ciências vegetais, uma vez que a maioria dos tecidos vegetais é composta por tecido leve (não denso) com baixa absorção de raios X⁸. As primeiras aplicações do micro-CT foram focadas no mapeamento de redes radiculares dentro da matriz do solo ^9,10. Posteriormente, estruturas vegetais com diferenças mais significativas na densidade de tecidos, como a madeira, começaram a ser exploradas. Isso tem permitido investigações da funcionalidade do xilema 11,12, desenvolvimento de organizações teciduais complexas^13,14 e interações entre plantas^15,16,17. A análise de tecidos moles e homogêneos está se tornando difundida devido aos agentes de contraste, que agora são procedimento padrão em preparações para micro-TC de amostras de plantas. No entanto, protocolos para introdução de contraste podem ter resultados diferentes dependendo do volume da amostra, das propriedades estruturais e do tipo de solução utilizada⁸. Idealmente, o contraste deve aumentar a distinção entre diferentes tecidos, permitir a avaliação da funcionalidade do tecido/órgão e/ou fornecer informações bioquímicas sobre um tecido¹⁸. Portanto, o tratamento, o preparo e a montagem adequados da amostra antes do exame tornam-se cruciais para qualquer análise de micro-TC.

Micro-CT do haustório da planta parasita
As plantas com flores parasitas representam um grupo funcional distinto de angiospermas caracterizadas por um órgão conhecido como haustório¹⁹. Esse órgão multicelular, um híbrido de desenvolvimento entre um caule modificado e uma raiz, atua na fixação, penetração e contato do hospedeiro por um parasita²⁰. Por essa razão, considera-se que o haustório “incorpora a própria ideia de parasitismo entre plantas”²¹. Uma compreensão detalhada do desenvolvimento, estrutura e funcionamento deste órgão é crucial para estudos de ecologia, evolução e manejo de plantas parasitas. No entanto, a complexidade geral das plantas parasitas e a estrutura e haustórios altamente modificados muitas vezes dificultam análises e comparações detalhadas. As conexões do Haustorium também costumam ser extensas e não homogêneas na distribuição tecidual e celular (Figura 1). Nesse contexto, embora o trabalho com pequenos fragmentos de tecido permita maior manipulação e maior resolução, pode levar a conclusões errôneas sobre a arquitetura tridimensional de estruturas complexas, como o haustório de plantas parasitas.

Embora exista uma vasta literatura sobre anatomia e ultraestrutura do haustório para a maioria das espécies de plantas parasitas, a organização tridimensional e a relação espacial entre os tecidos do parasita e do hospedeiro permanecem pouco exploradas¹⁷. Em um trabalho recente de Masumoto et ^al.22, mais de 300 cortes seriados de micrótomos semifinos foram fotografados e reconstruídos em um objeto virtual tridimensional representando o haustório de duas espécies de parasitas. O excelente nível de detalhe deste método fornece informações sem precedentes sobre a estrutura 3D celular e anatômica do haustório. No entanto, tal técnica demorada proibiria uma análise semelhante em parasitas com conexões de haustório mais extensas. O uso da micro-TC surge como uma excelente ferramenta para análise tridimensional de haustórios complexos e muitas vezes volumosos de plantas parasitas. Embora não substituam o corte anatômico detalhado e outras formas complementares de análise microscópica^17,23, os resultados obtidos por micro-TC, especialmente para amostras grandes, também podem servir como um guia para direcionar a subamostragem de segmentos menores, que podem ser analisados com outras ferramentas, como microscopia confocal e eletrônica^, ou reanalisados com sistemas de micro-TC de alta resolução.

Figura 1: Plantas parasitas de diferentes grupos funcionais utilizadas neste protocolo. Eufitóide parasita Pyrularia pubera (A), endoparasita Viscum minimum (B) com frutos verdes (círculo preto tracejado), cipó parasita Cuscuta americana (C), visco Struthanthus martianus (D), parasita radicular obrigatório Scybalium fungiforme (E). Segmentos da raiz do hospedeiro (Hr) ou caule (Hs) facilitam a aplicação do contraste no haustório do parasita (P). A presença de raiz/caule mãe do parasito (setas) na amostra permite a análise da organização dos vasos do haustório. Os retângulos indicam segmentos da amostra utilizada para análise. Barras de escala = 2 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

À medida que a micro-TC se torna uma técnica cada vez mais popular nas ciências vegetais, existem guias, protocolos e literatura que tratam de escaneamento de amostras, reconstrução tridimensional, segmentação e análise ^3,10,24. Assim, essas etapas não serão discutidas aqui. Como em qualquer técnica de imaginação, o tratamento adequado e a montagem de amostras são fundamentais, embora muitas vezes seja um procedimento negligenciado. Por esta razão, este protocolo concentra-se na preparação de amostras de haustório para micro-TC. Mais especificamente, este protocolo descreve duas abordagens para a introdução de agentes de contraste em amostras de haustório para melhorar a visualização de diferentes tecidos e tipos celulares no haustório, para facilitar a detecção de tecido parasitário dentro da raiz/caule do hospedeiro e para analisar as conexões vasculares parasita-hospedeiro em três dimensões. As preparações aqui descritas também podem ser adaptadas para a análise de outras estruturas vegetais.

Cinco espécies foram utilizadas para melhor ilustrar a conveniência do protocolo aqui descrito. Cada espécie representa um dos cinco grupos funcionais de plantas com flores parasitas, abordando assim pontos específicos relacionados à funcionalidade de cada grupo. Pyrularia pubera (Santalaceae) foi escolhida para representar os parasitas eufitóides, que germinam no solo e formam múltiplos haustórios que conectam o parasita às raízes de seus hospedeiros²⁵. Os haustórios criados por essas plantas são muitas vezes tênues e facilmente rasgados do hospedeiro²⁶ (Figura 1A), exigindo um processo de manuseio mais delicado. Os endoparasitas estão aqui representados por Viscum minimum (Viscaceae ). As espécies desse grupo funcional só são visíveis fora do corpo de seus hospedeiros por curtos períodos (Figura 1B) e vivem a maior parte de seus ciclos de vida como fitas de células significativamente reduzidas e semelhantes a micélios embutidas nos tecidos do hospedeiro²⁵. Um terceiro grupo funcional compreende as videiras parasitas, que germinam no solo, mas formam apenas raízes rudimentares, apoiando-se em múltiplos haustórios que se fixam aos caules das plantas hospedeiras²⁵ (Figura 1C). Aqui, este grupo funcional é representado por Cuscuta americana (Convolvulaceae). Ao contrário das videiras parasitas, os viscos germinam diretamente sobre os ramos de suas plantas hospedeiras e desenvolvem haustórios múltiplos ou solitários²⁵. A espécie escolhida para ilustrar este grupo funcional é Struthanthus martianus (Loranthaceae), que forma várias conexões com o ramo hospedeiro (Figura 1D). A análise do visco solitário haustório utilizando uma combinação de micro-TC e microscopia óptica pode ser encontrada em Teixeira-Costa e Ceccantini¹⁷. Finalmente, os parasitas radiculares obrigatórios compreendem espécies que germinam no solo e penetram nas raízes das plantas hospedeiras, das quais são inteiramente dependentes desde os estágios iniciais de crescimento²⁵. Essas plantas são representadas aqui por Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), que produzem grandes haustórios semelhantes a tubérculos (Figura 1E).

Todas as amostras de plantas utilizadas neste protocolo foram fixadas em álcool de ácido acético formalina 70% (FAA 70). A fixação no momento da amostragem é crucial para a preservação dos tecidos vegetais, especialmente se análises anatômicas subsequentes forem necessárias. No caso do haustório de plantas parasitas, a fixação também é essencial, pois esse órgão é frequentemente composto primariamente por células parenquimáticas não lignificadas²⁰. Protocolos detalhados para fixação de tecidos vegetais, incluindo a preparação de soluções fixadoras, podem ser encontrados em outros periódicos²⁷. Por outro lado, em maior ou menor grau, os fixadores podem causar alterações nas propriedades físicas e químicas de uma amostra, tornando-a inadequada para análises biomecânicas e histoquímicas específicas. Assim, amostras frescas, ou seja, material não fixado, coletado imediatamente antes do preparo, também podem ser utilizadas com esse protocolo. Detalhes sobre como lidar com amostras novas e sugestões de solução de problemas para material fixado são fornecidos na seção de discussão.

Protocol

1. Seleção de amostras de plantas parasitas Coletar todo o haustório da planta parasita, incluindo o caule/raiz do hospedeiro aderido e segmentos das extremidades proximal e distal do órgão hospedeiro parasitado; O comprimento ideal de cada segmento equivale ao dobro do diâmetro do haustório.NOTA: Para haustórios laterais, incluir parte do caule/raiz mãe do parasita a partir do qual o haustório foi formado (Figura 1A,B,D). Para endopa…

Representative Results

O haustório de plantas parasitas é um órgão complexo composto por diferentes tecidos e tipos celulares que se entrelaçam e se conectam com os tecidos de outra planta, utilizada como hospedeira20. A microtomografia computadorizada pode ser aproveitada para melhor entender essa complexa estrutura de forma não destrutiva e tridimensional ao analisar haustórios pequenos (Figura 1A-C) e grandes (Figura 1D,E).<s…

Discussion

O uso de soluções de metais pesados para melhorar o contraste do tecido vegetal tornou-se uma etapa crucial na preparação de amostras para análise de micro-TC. Vários compostos comumente disponíveis em laboratórios de micromorfologia vegetal foram testados por Staedler et al., que recomendam o uso do fosfotungstato como o agente mais eficaz em penetrar amostras e aumentar o índice de^contraste8. Os resultados aqui obtidos na análise do haustório de P. pubera corroboram essa reco…

Materials

3D X-ray microscope (XRM) system		Zeiss Versa 620	used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22	Zeiss	Versa 620	Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software	Nikon	version XT 3.1.11	Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software	Bruker	version 3.3.1	Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software	Object Research Systems – ORS	version	Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials	Glass Vials Inc. SE	V2708C-FM-SP	Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X	Zeiss	version XT 3.1.11	Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N	WR Chemicals BDH	BDH7422-1	Sold by VWR – USA
Lead Nitrate II PA 500 g	Vetec	361.08	Sold by SPLab
Microtomography scanner	Bruker	Skyscan1176	Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner	Nikon	X-Tek HMXST225	Used for scanning the species V. minimum
NRecon software	Bruker	version 1.0.0	Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	101410-756	Sold by VWR – USA
Plastic film (Parafilm)	Heathrow Scientific	PM996	Sold by VWR – USA
Plastic IV bag 500 mL	Taylor	3478	Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''	Nalge Nunc International	SC63013-164	Sold by VWR – USA
Scanning system		Nikon X-Tek HMXST225	used to scan Viscum minimum
Scanning system		Bruker Skyscan 1176	used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software	Zeiss	version 16	Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve	ToToT	DMTWVS-5	Sold by Amazon USA
Two-part syringe	HSW Henke-Ject	4850001000	Used without the plunger
Vacuum chamber	Binder	80080-434	Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software	Volume Graphics	version 3.0	Used for analyses and acquisition of images and videos