Parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taramasından yararlanma
Summary
Mikro-BT, bitki yapılarını üç boyutlu olarak analiz edebilen tahribatsız bir araçtır. Mevcut protokol, parazitik bitki yapısını ve işlevini analiz etmek için mikro-BT’den yararlanmak için numune hazırlamayı açıklamaktadır. Belirli preparatlarla birleştirildiğinde bu yöntemin avantajlarını vurgulamak için farklı türler kullanılır.
Abstract
Mikro-BT taraması, bitki yapısını ve işlevini araştırmada yerleşik bir araç haline gelmiştir. Tahribatsız doğası, üç boyutlu görselleştirme ve sanal bölümleme olasılığı ile birleştiğinde, karmaşık bitki organlarının yeni ve giderek daha ayrıntılı analizine izin vermiştir. Paraziter bitkiler ve konakçıları da dahil olmak üzere bitkiler arasındaki etkileşimler de araştırılabilir. Bununla birlikte, taramadan önce numune hazırlama, genellikle doku organizasyonu ve kompozisyonunda farklılık gösteren bu bitkiler arasındaki etkileşim nedeniyle çok önemli hale gelir. Ayrıca, parazitik çiçekli bitkilerin geniş çeşitliliği, oldukça azaltılmış bitkisel gövdelerden ağaçlara, bitkilere ve çalılara kadar, parazit konakçı materyalin örneklenmesi, işlenmesi ve hazırlanması sırasında dikkate alınmalıdır. Burada, haustoryumu analiz etmeye odaklanarak parazit ve / veya konakçı bitkilere kontrast çözeltileri sokmak için iki farklı yaklaşım açıklanmaktadır. Bu organ iki bitki arasındaki bağlantıyı ve iletişimi teşvik eder. Basit bir yaklaşımı takiben, haustorium doku organizasyonunun ayrıntıları, burada öfitoid, asma ve ökse otu parazitik türleri için gösterildiği gibi üç boyutlu olarak araştırılabilir. Spesifik zıt ajanların seçilmesi ve uygulama yaklaşımları, burada zorunlu bir kök parazit için gösterildiği gibi, konakçı vücutta endoparazit yayılımının ayrıntılı olarak gözlemlenmesine ve parazit ile konakçı arasındaki doğrudan damardan damara bağlantının tespit edilmesine de olanak tanır. Bu nedenle, burada tartışılan protokol, gelişimlerinin, yapılarının ve işlevlerinin anlaşılmasını ilerletmek için parazitik çiçekli bitkilerin geniş çeşitliliğine uygulanabilir.
Introduction
Yüksek çözünürlüklü röntgen mikrobilgisayarlı tomografi (mikro-BT), bir numunenin çoklu radyografilerinin (projeksiyonlarının) farklı görüş açılarından kaydedildiği ve daha sonra numunenin sanal bir rekonstrüksiyonunu sağlamak için kullanıldığı bir görüntüleme yöntemidir1. Bu sanal nesne daha sonra analiz edilebilir, manipüle edilebilir ve bölümlere ayrılabilir, böylece üç boyutlu2’de tahribatsız keşif yapılabilir. Başlangıçta tıbbi analizler ve daha sonra endüstriyel uygulamalar için tasarlanan mikro-BT, invaziv prosedürlere gerek kalmadan iç organları ve dokuları görselleştirme avantajı da sunar3. Diğer görüntüleme biçimleri gibi, mikro-BT de görüş alanı ve piksel boyutu arasında bir denge ile çalışır, bu da büyük örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesinin neredeyse ulaşılamaz olduğu anlamına gelir4. Yüksek enerjili X-ışını kaynaklarının (yani senkrotron) ve ikincil optik büyütmenin kullanımındaki ilerlemeler sürekli olarak yapılmakta ve en küçük çözünürlüğün 100 nm 5,6’nın altına ulaşmasına izin verilmektedir. Bununla birlikte, büyük numuneler için daha uzun tarama süreleri gereklidir, bu da tarayıcı içindeki numune hareketi veya deformasyonu nedeniyle artefakt olasılığını artırır. Ayrıca, mikro-BT genellikle numune içindeki doğal yoğunluk değişimleri ve numunenin X-ışınları ile nasıl etkileşime girdiği ile sınırlıdır. Daha yoğun numunelere nüfuz etmek için daha yüksek bir X-ışını dozu en iyisi olsa da, numune ile çevresindeki ortam7 içindeki ve arasındaki yoğunluk değişikliklerini yakalamada daha az etkilidir. Öte yandan, daha düşük bir X-ışını dozu daha az penetrasyon gücü sunar ve genellikle daha uzun tarama süreleri gerektirir, ancak yoğunluk algılamada daha fazla hassasiyet gerektirir7.
Bu kısıtlamalar, çoğu bitki dokusunun düşük X-ışını emilimine sahip hafif (yoğun olmayan) dokudan oluştuğu göz önüne alındığında, bitki bilimleri için mikrotomografi kullanımını uzun zamandır engellemiştir8. Mikro-BT’nin ilk uygulamaları, toprak matrisi 9,10 içindeki kök ağlarının haritalandırılmasına odaklanmıştır. Daha sonra, ahşap gibi doku yoğunluğunda daha önemli farklılıklar gösteren bitki yapıları araştırılmaya başlandı. Bu, ksilem işlevselliğinin 11,12, karmaşık doku organizasyonlarının gelişiminin 13,14 ve bitkiler arasındaki etkileşimlerinaraştırılmasına izin vermiştir 15,16,17. Yumuşak ve homojen doku analizi, bitki örneklerinin mikro-BT taraması için preparatlarda artık standart prosedür olan kontrast maddeler nedeniyle yaygınlaşmaktadır. Bununla birlikte, kontrast tanıtımı protokolleri, numune hacmine, yapısal özelliklere ve kullanılan çözeltinin türüne bağlı olarak farklı sonuçlara sahip olabilir8. İdeal olarak, kontrast madde farklı dokular arasındaki ayrımı arttırmalı, doku/organ işlevselliğinin değerlendirilmesini sağlamalı ve/veya bir doku hakkında biyokimyasal bilgi sağlamalıdır18. Bu nedenle, taramadan önce yeterli numune tedavisi, hazırlanması ve montajı, herhangi bir mikro-BT analizi için çok önemli hale gelir.
Parazitik bitki haustoriumunun mikro-BT’si
Parazitik çiçekli bitkiler, haustorium19 olarak bilinen bir organ ile karakterize edilen anjiyospermlerin ayrı bir fonksiyonel grubunu temsil eder. Modifiye edilmiş bir kök ve bir kök arasındaki gelişimsel bir melez olan bu çok hücreli organ, konakçının bağlanmasına, nüfuz etmesine ve bir parazit20 ile temasına etki eder. Bu nedenle, haustoriumun “bitkiler arasındaki parazitizm fikrini somutlaştırdığı”21 düşünülmektedir. Bu organın gelişiminin, yapısının ve işleyişinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, parazitik bitki ekolojisi, evrimi ve yönetimi çalışmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, parazitik bitkilerin genel karmaşıklığı ve yüksek oranda değiştirilmiş yapısı ve haustoria genellikle ayrıntılı analiz ve karşılaştırmayı engellemektedir. Haustorium bağlantıları da genellikle geniştir ve doku ve hücre dağılımında homojen değildir (Şekil 1). Bu bağlamda, küçük doku parçaları ile çalışmak daha kolay manipülasyon ve daha yüksek çözünürlük sağlarken, parazitik bitki haustorium gibi karmaşık yapıların üç boyutlu mimarisi hakkında hatalı sonuçlara yol açabilir.
Çoğu parazitik bitki türü için haustorium anatomisi ve ultrayapısı hakkında geniş bir literatür olmasına rağmen, parazit ve konakçı dokular arasındaki üç boyutlu organizasyon ve mekansal ilişki hala yeterince araştırılmamıştır17. Masumoto ve ark.22 tarafından yapılan yakın tarihli bir çalışmada, 300’den fazla seri yarı ince mikrotom bölümü görüntülendi ve iki parazit türünün haustoriumunu temsil eden üç boyutlu bir sanal nesneye yeniden yapılandırıldı. Bu yöntemin mükemmel ayrıntı seviyesi, haustoriumun hücresel ve anatomik 3-D yapısı hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sağlar. Bununla birlikte, böyle zaman alıcı bir teknik, daha kapsamlı haustorium bağlantılarına sahip parazitlerde benzer bir analizi yasaklayacaktır. Mikro-BT kullanımı, parazitik bitkilerin karmaşık ve genellikle hacimli haustorialarının üç boyutlu analizi için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıntılı anatomik kesitleme ve mikroskopi analizlerinin diğer tamamlayıcı formlarının yerine geçmese de17,23, özellikle büyük numuneler için mikro-BT taraması yoluyla elde edilen sonuçlar, daha sonra konfokal ve elektron mikroskobu gibi diğer araçlar kullanılarak analiz edilebilen veya yüksek çözünürlüklü mikro-BT sistemleriyle yeniden analiz edilebilen daha küçük segmentlerin alt örneklemesini yönlendirmek için bir rehber görevi görebilir.
Şekil 1: Bu protokolde kullanılan farklı fonksiyonel gruplara ait paraziter bitkiler. Euphytoid parazit Pyrularia pubera (A), endoparazit Viscum minimum (B) yeşil meyveler (kesikli siyah daire), parazitik asma Cuscuta americana (C), ökse otu Struthanthus martianus (D), zorunlu kök paraziti Scybalium fungiforme (E). Konakçı kökün (Hr) veya gövdenin (Hs) segmentleri, parazit haustoriuma (P) kontrast uygulanmasını kolaylaştırır. Numunede parazit ana kökü/gövdesinin (okların) varlığı, haustorium damar organizasyonunun analizine olanak sağlar. Dikdörtgenler, analiz için kullanılan numunenin segmentlerini gösterir. Ölçek çubukları = 2 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Mikro-BT, bitki bilimlerinde giderek daha popüler bir teknik haline geldikçe, örnek tarama, üç boyutlu rekonstrüksiyon, segmentasyon ve analiz 3,10,24 ile ilgili kılavuzlar, protokoller ve literatür bulunmaktadır. Bu nedenle, bu adımlar burada tartışılmayacaktır. Herhangi bir hayal etme tekniğinde olduğu gibi, numunelerin uygun şekilde işlenmesi ve montajı, çoğu zaman göz ardı edilen bir prosedür olmasına rağmen, temel bir prosedürdür. Bu nedenle, bu protokol mikro-BT taraması için haustorium örneklerinin hazırlanmasına odaklanmaktadır. Daha spesifik olarak, bu protokol, haustoriumdaki farklı dokuların ve hücre tiplerinin görselleştirilmesini iyileştirmek, konakçı kök / kök içindeki parazitik dokunun tespitini kolaylaştırmak ve parazit-konakçı vasküler bağlantılarını üç boyutlu olarak analiz etmek için haustoryum örneklerine kontrast maddeler sokmak için iki yaklaşımı açıklamaktadır. Burada açıklanan preparatlar, diğer bitki yapılarının analizine de uyarlanabilir.
Burada açıklanan protokolün rahatlığını daha iyi göstermek için beş tür kullanılmıştır. Her tür, parazitik çiçekli bitkilerin beş fonksiyonel grubundan birini temsil eder, böylece her grubun işlevselliği ile ilgili belirli noktaları ele alır. Pyrularia pubera (Santalaceae), toprakta çimlenen ve paraziti konakçılarının köklerine bağlayan çoklu haustoria oluşturan öfitoid parazitleri temsil etmek üzere seçildi25. Bu bitkiler tarafından yaratılan haustoria genellikle zayıftır ve konakçı26’dan kolayca ayrılır (Şekil 1A), bu nedenle daha hassas bir işleme süreci gerektirir. Endoparazitler burada Viscum minimum (Viscaceae) ile temsil edilir. Bu fonksiyonel gruptaki türler sadece kısa süreler için konakçılarının vücudunun dışında görülebilir (Şekil 1B) ve yaşam döngülerinin çoğunu konakçı dokuların içine gömülü hücrelerin önemli ölçüde azalmış ve miselli benzeri iplikçikleri olarak yaşarlar25. Üçüncü bir fonksiyonel grup, zeminde çimlenen, ancak konakçı bitkilerin gövdelerine bağlanan çoklu haustorialara dayanan sadece ilkel kökler oluşturan parazitik asmalardan oluşur25 (Şekil 1C). Burada, bu fonksiyonel grup Cuscuta americana (Convolvulaceae) ile temsil edilmektedir. Parazitik asmaların aksine, ökse otu doğrudan konakçı bitkilerinin dalları üzerinde çimlenir ve çoklu veya yalnız haustoria25 geliştirir. Bu fonksiyonel grubu göstermek için seçilen tür, konakçı dal ile çeşitli bağlantılar oluşturan Struthanthus martianus’tur (Loranthaceae). Mikro-BT ve ışık mikroskobu kombinasyonu kullanılarak yalnız ökse otu haustoria’nın analizi Teixeira-Costa &; Ceccantini17’de bulunabilir. Son olarak, zorunlu kök parazitleri, zeminde çimlenen ve en erken büyüme aşamalarından25’ten itibaren tamamen bağımlı oldukları konakçı bitkilerin köklerine nüfuz eden türlerden oluşur. Bu bitkiler burada büyük yumru benzeri haustoria üreten Scybalium fungiforme (Balanophoraceae) ile temsil edilmektedir (Şekil 1E).
Bu protokolde kullanılan tüm bitki örnekleri% 70 formalin asetik asit alkolüne (FAA 70) sabitlenmiştir. Örnekleme üzerine sabitleme, özellikle daha sonraki anatomik analizlere ihtiyaç duyulduğunda, bitki dokularını korumak için çok önemlidir. Parazitik bitki haustorium durumunda, fiksasyon da önemlidir, çünkü bu organ genellikle öncelikle odunlaşmamış parankim hücrelerinden oluşur20. Fiksatif çözeltilerin hazırlanması da dahil olmak üzere bitki dokusu fiksasyonu için ayrıntılı protokoller başka bir yerde bulunabilir27. Öte yandan, fiksatifler az ya da çok bir dereceye kadar, bir numunenin fiziksel ve kimyasal özelliklerinde değişikliklere neden olabilir ve bu da numuneyi spesifik biyomekanik ve histokimyasal analizler için uygun hale getiremez. Böylece, taze numuneler, yani hazırlıktan hemen önce toplanan sabitlenmemiş malzeme de bu protokolle kullanılabilir. Yeni numunelerin nasıl işleneceğine ilişkin ayrıntılar ve sabitlenmiş malzeme için sorun giderme önerileri tartışma bölümünde verilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bitki dokusu kontrastını iyileştirmek için ağır metal çözeltilerinin kullanılması, mikro-BT analizi için numune hazırlamada çok önemli bir adım haline gelmiştir. Bitki mikromorfolojisi laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan çeşitli bileşikler, fosfotungstatın nüfuz eden numunelerde ve kontrast indeksi8’in arttırılmasında en etkili ajan olarak kullanılmasını öneren Staedler ve ark. tarafından test edilmiştir. Burada P. pubera haustoriumunun analizinde elde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Simone Gomes Ferreira’ya (Mikrotomografi Laboratuvarı, Sao Paulo Üniversitesi, Brezilya) ve Dr. Greg Lin’e (Nano Ölçekli Sistemler Merkezi, Harvard Üniversitesi, ABD) farklı mikrotomografi sistemleri ve veri analiz yazılımları için üstün yardımları ve vazgeçilmez kullanıcı eğitimleri için teşekkür ederim. Ayrıca Connecticut Üniversitesi’ndeki (ABD) EEB Sera personeline, özellikle Clinton Morse ve Matthew Opel’e Viscum minimum örneklerini sağladıkları için teşekkür ediyorum. Dr. John Wenzel, Pyrularia pubera’nın örneklenmesi için fırsat ve büyük yardım sağladı. Carolina Bastos, Yasmin Hirao ve Talitha Motta, Scybalium fungiforme’un örneklenmesinde büyük ölçüde yardımcı oldu. Yüksek Lisans Ariadne Furtado ve Dr. Fernanda Oliveira ve Maria Aline Neves, endofitik mantarların analizi için floksin B kullanımı için referans sağlamıştır. Brüksel Vrije Üniversitesi’nde video kaydı, Dr. Philippe Claeys, Dr. Christophe Snoeck, MSc. Jake Griffith, Dr. Barabara Veselka ve Dr. Harry Olde Venterink’in yardımıyla mümkün oldu. Finansman, Yüksek Öğretim Personelinin İyileştirilmesi Koordinasyonu (CAPES, Brezilya) ve Harvard Üniversitesi Herbarisi (ABD) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems – ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR – USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR – USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR – USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR – USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
References
- Stock, S. R. . Microcomputed tomography: Methodology and applications. , (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
- Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
- Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
- Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
- Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
- Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
- Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
- da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
- Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
- Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface – Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
- Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
- Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
- Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
- Kuijt, J. . The Biology of Parasitic Flowering Plants. , (1969).
- Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
- Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains’ morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
- Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
- Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
- Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
- Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world’s largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
- Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
- Largent, D., Johnson, D., Watling, R. . How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , (1977).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
- Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
- Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
- Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).
