Summary

탠덤 이온 이동성 실험을 위한 순환 이온 이동성 분광계 사용

Published: January 20, 2022
doi:

Summary

이온 이동성 분광법 (IMS)은 생체 분자의 특성화를위한 질량 분광법에 대한 흥미로운 보완물이며, 특히 이성체에 민감하기 때문입니다. 이 프로토콜은 분자의 분리 및 그 단편의 이동성 프로파일의 생성을 허용하는 탠덤 IMS (IMS/IMS) 실험을 설명합니다.

Abstract

화학 구조의 정확한 특성화는 근본적인 생물학적 메커니즘과 기능적 특성을 이해하는 데 중요합니다. 질량 분광법 (MS)은 인기있는 도구이지만 모든 구조적 특징을 완전히 드러내기에 항상 충분하지는 않습니다. 예를 들어, 탄수화물은 생물학적으로 관련이 있지만, 그 특성화는 수많은 수준의 이성체에 의해 복잡합니다. 이온 이동성 분광법 (IMS)은 이온 입체 형태에 민감하고 따라서 이성체에 민감하기 때문에 흥미로운 보완물입니다.

또한, 최근 발전으로 기술이 크게 향상되었습니다: 마지막 세대의 순환 IMS 계측기는 향상된 분해능 또는 탠덤 이온 이동성(IMS/IMS) 실험을 수행할 수 있는 가능성과 같은 선형 IMS 계측기에 비해 추가 기능을 제공합니다. IMS/IMS 동안, 이온은 이온 이동성에 기초하여 선택되고, 단편화되고, 그 단편에 대한 이온 이동성 정보를 얻기 위해 재분석된다. 최근의 연구에 따르면 이러한 IMS / IMS 데이터에 포함 된 단편의 이동성 프로파일은 특정 글리 칸의 지문으로 작용할 수 있으며 구조적으로 관련된 방식으로 글리코믹 데이터 세트를 구성하기위한 분자 네트워킹 전략에 사용될 수 있습니다.

따라서 이 프로토콜의 목표는 샘플 준비부터 재현 가능한 스펙트럼을 산출하는 이온 이동성 차원의 최종 CCS(충돌 횡단면) 교정에 이르기까지 IMS/IMS 데이터를 생성하는 방법을 설명하는 것입니다. 하나의 대표적인 글리칸의 예를 들자면, 이 프로토콜은 순환 IMS 장비에 IMS/IMS 제어 시퀀스를 구축하는 방법, IMS 도달 시간을 드리프트 시간(즉, 이온에 적용된 효과적인 분리 시간)으로 변환하기 위해 이 제어 시퀀스를 설명하는 방법, 그리고 원시 데이터로부터 관련 이동성 정보를 추출하는 방법을 보여줄 것이다. 이 프로토콜은 IMS/IMS 실험의 중요 사항을 명확하게 설명하도록 설계되었으므로 새로운 순환 IMS 사용자가 간단하고 재현 가능한 인수를 수행할 수 있도록 도와줍니다.

Introduction

생체 분자의 완전한 화학적 특성화는 근본적인 생물학적 및 기능적 특성을 이해하는 열쇠입니다. 이를 위해 “omics”과학은 최근 몇 년 동안 생물학적 농도에서 화학 구조의 대규모 특성화를 목표로 발전했습니다. 프로테오믹스 및 대사체학에서 MS는 생물학적 매질에서 발견되는 구조적 이질성을 푸는 핵심 도구가되었으며, 특히 탠덤 MS (MS / MS)를 통해 구조 정보를 제공 할 수있는 감도와 능력 덕분입니다. MS / MS 전략에서 이온은 질량에 따라 선택된 다음 단편화되고 마지막으로 분자의 지문을 확립하기 위해 단편의 질량을 획득합니다. MS/MS 스펙트럼은, 특히, 스펙트럼 데이터베이스1,2와 일치시키거나, 부모 구조3,4를 잠정적으로 재구성하는데 사용될 수 있다. 유사한 스펙트럼이 유사한 화합물에 속한다는 가정 하에서, MS/MS 데이터는 유사성 점수5,6을 통해 관련 종을 연결하는 분자 네트워크(MN)를 구축하는데 사용될 수도 있다.

그러나, 이온의 질량 대 전하 비율 (m/z)을 검출하는 MS의 고유 한 특성 때문에, 기술은 (스테레오) 이성질체의 범위 내에 속하는 다수의 구조적 특징에 눈이 멀다. 예를 들어, 탄수화물은 몇몇 단당류 서브유닛으로 만들어지며, 이들 중 다수는 입체이성질체 또는 심지어 에피머(예를 들어, Glc vs. Gal 또는 Glc vs. Man)이다. 이들 서브유닛은 글리코시드 결합에 의해 연결되며, 이는 아노머 탄소의 결합(regioisomerism) 및 입체 구성(anomerism)의 위치에 의해 상이할 수 있다. 이러한 특성은 독립형 MS가 탄수화물 이성질체7를 구별하는 것을 어렵게 만들고, 고에너지 활성화 방법8,9,10을 사용하여 위치 이성체주의만을 해결할 수 있다. 유도체화는 입체이성체기11의 동등성을 방해하는 옵션이지만, 광범위한 샘플 준비가 필요하다. 또 다른 더 간단한 옵션은 MS를 IMS와 같은 이성체에 민감한 분석 차원과 결합하는 것입니다.

이 프로토콜은 IMS의 기본 개념에 이미 익숙한 사용자를 위해 설계되었으며 자세한 검토는 다른 곳에서12,13 사용할 수 있기 때문에 IMS의 원칙에 대한 간략한 개요 만 여기에 나와 있습니다. IMS는 버퍼 가스 및 전기장과의 이온의 상호 작용에 의존하여 궁극적으로 기상 형태에 따라 이온을 분리하는 기상 분리 방법입니다. MS에 결합된 IMS의 다른 원리는 상용 기기에서 찾을 수 있습니다: 일부는 높은 전기장과 낮은 전기장(필드 비대칭 IMS, FAIMS)을 번갈아 가며 작동하는 반면, 대부분은 낮은 필드 한계 내에서 작동하며, 특히 드리프트 튜브 IMS(DTIMS, 선형적으로 감소하는 전기장), 이동파 IMS(TWIMS, 대칭 전위파), 갇힌 IMS(TIMS, 전기장에 대한 버퍼 가스 포획 이온의 높은 흐름)13 . 낮은 필드 방법은 분리 중에 버퍼 가스와 상호 작용하는 이온의 표면 (Å2 또는 nm2)을 나타내는 이온 – 가스 쌍의 특성 인 소위 CCS에 대한 액세스를 허용합니다. CCS는 이론적으로 계측기와 무관하므로 서로 다른 실험실 간에 재생할 수 있는 데이터를 생성하는 데 유용합니다14. 이온 이동성 분리는 다양한 파라미터, 특히 이동성 셀의 가스 압력 및 가스 온도의 변동에 의해 영향을 받을 수 있습니다. CCS 교정은 교정제와 관심 종 모두 유사하게 영향을 받기 때문에이를 해결할 수있는 방법입니다13. 그러나 온도 조절실에 계측기를 설치하고 신뢰할 수있는 가스 압력 제어 시스템을 갖추어야합니다.

IMS의 흥미로운 진화는 IMS / IMS로, 2006 년 Clemmer의 그룹에 의해 MS / MS15,16의 아날로그로 처음 소개되었습니다. IMS/IMS에서, 관심 이온은 이온 이동성에 기초하여 선택적으로 분리된다; 이어서, 활성화되고(가능한 단편화까지), 활성화된 이온 또는 단편의 새로운 IMS 분석이 수행된다. 첫 번째 도구 설계에서는 두 개의 IMS 셀을 직렬로 배치하여 활성화가 서있는 이온 깔때기로 분리했습니다. 그 이후로 여러 IMS / IMS 설정이 제안되었지만 (검토를 위해 Eldrid 및 Thalassinos17 참조), IMS / IMS 기능을 갖춘 최초의 상업용 질량 분광계는 201918 년에만 사용할 수있게되었습니다. 이 장비는 IMS 셀의 순환 설계라는 또 다른 기술적 혁신과 결합하여 초기 개념을 크게 개선했습니다.

순환 IMS 셀은 이론적으로 드리프트 경로 길이를 거의 무한히 증가시킬 수 있게 하며, 따라서 계측기의 분해능19을 증가시킨다. 이것은 순환 TWIMS 셀이 주 이온 광학 축에 직교하여 배치되는 특정 계측기 형상에 의해 달성되었다. IMS 셀의 입구에 있는 다기능 어레이 영역은 이온 경로의 방향을 제어할 수 있게 한다: (i) IMS 분리를 위해 이온을 옆으로 보내는 것, (ii) MS 검출을 위해 앞으로 보내는 것, 또는 (iii) IMS 셀로부터 후진하여 프리어레이 셀에 저장될 수 있다. 이러한 프리어레이 저장 세포로부터, 이온이 활성화될 수 있고 단편이 이온 이동성 측정을 위해 IMS 셀에 재주입될 수 있으며, 이는 입체이성질체20을 특성화하는데 성공적으로 사용된 접근법이다. 궁극적으로, 수집된 데이터에는 전구체 및 그 단편에 대한 이온 이동성 및 m/z 정보가 포함됩니다.

글리칸 분석을 위해이 순환 설계를 사용한 최근 간행물 (Ollivier et al.21)에서 우리는 그러한 IMS / IMS 데이터에 포함 된 단편의 이동성 프로파일이 분자 네트워킹 전략에 사용될 수있는 생체 분자의 지문으로 작용한다는 것을 보여주었습니다. IM-MN이라고 불리는 결과 네트워크는 구조적으로 관련된 방식으로 글리코믹스 데이터 세트를 구성하게 된 반면, MS/MS 데이터(MS-MN)로만 구축된 네트워크는 거의 정보를 공개하지 않았습니다. 이 간행물을 보완하고 Cyclic IMS 사용자가 이 워크플로를 구현하는 데 도움이 되도록 이 프로토콜은 데이터 수집에 사용되는 프로토콜에 대한 전체 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 사용자가 IM-MN 네트워크(see21)를 구축하는 데 사용할 수 있는 IMS/IMS 데이터 생성에만 초점을 맞춥니다. IM-MN의 구축은 분자 네트워킹을 위한 프로토콜이 이미 이용가능하기 때문에22 본 명세서에서 고려되지 않을 것이다. 가치 있고 재현 가능한 IMS/IMS 인수를 생성하기 위해 따라야 할 중요한 사항이 강조됩니다. Ollivier et al.에 의해 연구 된 올리고당 중 하나의 예를 들면. 도 21에 도시된 바와 같이, 다음의 단계들이 상세하다: (i) 샘플 준비, (ii) 사이클릭 IMS 계측기의 튜닝, (iii) 데이터의 자동화된 피크 피킹, 및 (iv) CCS 캘리브레이션.

Protocol

참고: 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 본 프로토콜에 기재된 실험에 사용된 파라미터는 보충 표 S1 및 보충 표 S2에서 찾을 수 있다. 1. 시료용액의 제조 참고: 프로토콜은 아라비녹실란 펜타사카라이드(23-α-L-아라비노푸라노실-크실로테트라오스 또는 XA2XX; ?…

Representative Results

아라비녹실란 오타당류인 XA2XX가 이 프로토콜을 설명하기 위한 예로 선택되었다. 이 화합물은 상업적으로 입수가능하지만, 단지 다른 아라비녹실란 펜타사카라이드 XA3XX(순수한 XA3XX도 상업적으로 입수가능함)와의 혼합물로서만 입수가능하다. XA2XX 및 XA3XX의 구조는 보충 그림 S1에 나와 있습니다. 상용 혼합물 중의 XA2XX와 XA3XX의 비율이…

Discussion

SELECT SERIES 순환 IMS는 업스트림 크로마토그래피 분리 없이 정의된 이온 집단(주어진 m/z 및 이온 이동성)을 선택할 수 있는 강력한 도구입니다. 이 계측기는 MS/MS 및 IMS/IMS 스펙트럼을 모두 추출할 수 있는 이 이온 집단의 이차원 단편화 맵을 생성할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 사용자는 실험 프로세스 중에주의가 필요한 몇 가지 중요한 점에 유의해야합니다.

먼…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.O.는 그의 박사 학위 (보조금 ANR-18-CE29-0006)에 자금을 지원 한 프랑스 국립 연구소에 감사드립니다.

Materials

33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

References

  1. Allard, P. -. M., et al. Integration of molecular networking and in-silico MS/MS fragmentation for natural products dereplication. Analytical Chemistry. 88 (6), 3317-3323 (2016).
  2. Wang, M., et al. Mass spectrometry searches using MASST. Nature Biotechnology. 38 (1), 23-26 (2020).
  3. David, M., Fertin, G., Rogniaux, H., Tessier, D. SpecOMS: a full open modification search method performing all-to-all spectra comparisons within minutes. Journal of Proteome Research. 16 (8), 3030-3038 (2017).
  4. Dührkop, K., et al. SIRIUS 4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information. Nature Methods. 16 (4), 299-302 (2019).
  5. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  6. Nothias, L. -. F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  7. Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the Carbohydrate Sequencing Challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
  8. Ropartz, D., et al. Online coupling of high-resolution chromatography with extreme UV photon activation tandem mass spectrometry: Application to the structural investigation of complex glycans by dissociative photoionization. Analytica Chimica Acta. 933, 1-9 (2016).
  9. Wolff, J. J., et al. Negative electron transfer dissociation of glycosaminoglycans. Analytical Chemistry. 82 (9), 3460-3466 (2010).
  10. Ropartz, D., et al. Charge transfer dissociation of complex oligosaccharides: comparison with collision-induced dissociation and extreme ultraviolet dissociative photoionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (10), 1614-1619 (2016).
  11. Morelle, W., et al. Fragmentation characteristics of permethylated oligosaccharides using a matrix-assisted laser desorption/ionization two-stage time-of-flight (TOF/TOF) tandem mass spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 18 (22), 2637-2649 (2004).
  12. Gabelica, V., Marklund, E. Fundamentals of ion mobility spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 42, 51-59 (2018).
  13. Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility mass spectrometry measurements. Mass Spectrometry Reviews. 38 (3), 291-320 (2019).
  14. Hernandez-Mesa, M., et al. Interlaboratory and interplatform study of steroids collision cross section by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (7), 5013-5022 (2020).
  15. Koeniger, S. L., et al. An IMS-IMS analogue of MS-MS. Analytical Chemistry. 78 (12), 4161-4174 (2006).
  16. Merenbloom, S. I., Koeniger, S. L., Valentine, S. J., Plasencia, M. D., Clemmer, D. E. IMS−IMS and IMS−IMS−IMS/MS for separating peptide and protein fragment ions. Analytical Chemistry. 78 (8), 2802-2809 (2006).
  17. Eldrid, C., Thalassinos, K. Developments in tandem ion mobility mass spectrometry. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2457-2466 (2020).
  18. Giles, K., et al. A cyclic ion mobility-mass spectrometry system. Analytical Chemistry. 91 (13), 8564-8573 (2019).
  19. Merenbloom, S. I., Glaskin, R. S., Henson, Z. B., Clemmer, D. E. High-resolution ion cyclotron mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (4), 1482-1487 (2009).
  20. Ollivier, S., et al. Anomeric retention of carbohydrates in multistage cyclic ion mobility (IMSn): de novo structural elucidation of enzymatically produced mannosides. Analytical Chemistry. 93 (15), 6254-6261 (2021).
  21. Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Molecular networking of high-resolution tandem ion mobility spectra: a structurally relevant way of organizing data in glycomics. Analytical Chemistry. 93 (31), 10871-10878 (2021).
  22. Aron, A. T., et al. Reproducible molecular networking of untargeted mass spectrometry data using GNPS. Nature Protocols. 15 (6), 1954-1991 (2020).
  23. McKenna, K. R., Li, L., Krishnamurthy, R., Liotta, C. L., Fernández, F. M. Organic acid shift reagents for the discrimination of carbohydrate isobars by ion mobility-mass spectrometry. The Analyst. 145 (24), 8008-8015 (2021).
  24. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  25. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L. P., Sandercock, A. M., Hyung, S. -. J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  26. Bush, M. F., Hall, Z., Giles, K., Hoyes, J., Robinson, C. V., Ruotolo, B. T. Collision cross sections of proteins and their complexes: a calibration framework and database for gas-phase structural biology. Analytical Chemistry. 82 (22), 9557-9565 (2010).
  27. Ropartz, D., et al. Structure determination of large isomeric oligosaccharides of natural origin through multipass and multistage cyclic traveling-wave ion mobility mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (18), 12030-12037 (2019).
  28. Tolmachev, A. V., et al. Characterization of ion dynamics in structures for lossless ion manipulations. Analytical Chemistry. 86 (18), 9162-9168 (2014).
  29. Arndt, J. R., et al. High-resolution ion-mobility-enabled peptide mapping for high-throughput critical quality attribute monitoring. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2019-2032 (2021).
  30. Le Fèvre, A., Dugourd, P., Chirot, F. Exploring conformational landscapes using trap and release tandem ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (9), 4183-4190 (2021).
  31. Ohshimo, K., He, X., Ito, R., Misaizu, F. Conformer separation of dibenzo-crown-ether complexes with Na+ and K+ ions studied by cryogenic ion mobility-mass spectrometry. The Journal of Physical Chemistry A. 125 (17), 3718-3725 (2021).
  32. Purves, R. W., Barnett, D. A., Ells, B., Guevremont, R. Gas-phase conformers of the [M + 2H]2+ ion of bradykinin investigated by combining high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, hydrogen/deuterium exchange, and energy-loss measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 15 (16), 1453-1456 (2001).
  33. Ujma, J., et al. Cyclic ion mobility mass spectrometry distinguishes anomers and open-ring forms of pentasaccharides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (6), 1028-1037 (2019).
  34. Warnke, S., Faleh, A. B., Scutelnic, V., Rizzo, T. R. Separation and identification of glycan anomers using ultrahigh-resolution ion-mobility spectrometry and cryogenic ion spectroscopy. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 30 (11), 2204-2211 (2019).
  35. Williamson, D. L., Bergman, A. E., Nagy, G. Investigating the structure of α/β carbohydrate linkage isomers as a function of group I metal adduction and degree of polymerization as revealed by cyclic ion mobility separations. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (10), 2573-2582 (2021).
  36. Myers, O. D., Sumner, S. J., Li, S., Barnes, S., Du, X. One step forward for reducing false positive and false negative compound identifications from mass spectrometry metabolomics data: new algorithms for constructing extracted ion chromatograms and detecting chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 89 (17), 8696-8703 (2017).
  37. Marchand, A., Livet, S., Rosu, F., Gabelica, V. Drift tube ion mobility: how to reconstruct collision cross section distributions from arrival time distributions. Analytical Chemistry. 89 (23), 12674-12681 (2017).
  38. Davis, D. M., et al. Analysis of ion mobility spectra for mixed vapors using Gaussian deconvolution. Analytica Chimica Acta. 289 (3), 263-272 (1994).
  39. Polasky, D. A., Dixit, S. M., Fantin, S. M., Ruotolo, B. T. CIUSuite 2: next-generation software for the analysis of gas-phase protein unfolding data. Analytical Chemistry. 91 (4), 3147-3155 (2019).
  40. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  41. Gelb, A. S., Jarratt, R. E., Huang, Y., Dodds, E. D. A study of calibrant selection in measurement of carbohydrate and peptide ion-neutral collision cross sections by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (22), 11396-11402 (2014).
  42. Richardson, K., Langridge, D., Dixit, S. M., Ruotolo, B. T. An improved calibration approach for traveling wave ion mobility spectrometry: robust, high-precision collision cross sections. Analytical Chemistry. 93 (7), 3542-3550 (2021).
check_url/kr/63451?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

View Video