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화학

Usando um espectrômetro de mobilidade de íons cíclicos para experimentos de mobilidade de íons tandem

Published: January 20, 2022
doi:
10.3791/63451
, , ,
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

A espectrometria de mobilidade de íons (IMS) é um complemento interessante à espectrometria de massa para a caracterização de biomoléculas, notadamente por ser sensível ao isomerismo. Este protocolo descreve um experimento tandem IMS (IMS/IMS), que permite o isolamento de uma molécula e a geração dos perfis de mobilidade de seus fragmentos.

Abstract

A caracterização precisa das estruturas químicas é importante para entender seus mecanismos biológicos subjacentes e propriedades funcionais. A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta popular, mas nem sempre é suficiente para desvendar completamente todas as características estruturais. Por exemplo, embora os carboidratos sejam biologicamente relevantes, sua caracterização é complicada por inúmeros níveis de isomerismo. A espectrometria de mobilidade de íons (IMS) é um complemento interessante porque é sensível às conformações de íons e, portanto, ao isomerismo.

Além disso, os avanços recentes melhoraram significativamente a técnica: a última geração de instrumentos IMS cíclicos oferece recursos adicionais em comparação com instrumentos lineares de IMS, como um aumento da potência de resolução ou a possibilidade de realizar experimentos de mobilidade de íons tandem (IMS/IMS). Durante o IMS/IMS, um íon é selecionado com base em sua mobilidade de íons, fragmentado e reanalisado para obter informações sobre mobilidade de íons sobre seus fragmentos. Trabalhos recentes mostraram que os perfis de mobilidade dos fragmentos contidos em tais dados IMS/IMS podem atuar como uma impressão digital de um glicano específico e podem ser usados em uma estratégia de rede molecular para organizar conjuntos de dados glicómicos de forma estruturalmente relevante.

O objetivo deste protocolo é, portanto, descrever como gerar dados IMS/IMS, desde a preparação da amostra até a calibração final da Seção Transversal de Colisão (CCS) da dimensão de mobilidade de íons que produz espectros reprodutíveis. Tomando o exemplo de um glycan representativo, este protocolo mostrará como construir uma sequência de controle IMS/IMS em um instrumento IMS Cíclico, como explicar essa sequência de controle para traduzir o tempo de chegada do IMS em tempo de deriva (ou seja, o tempo efetivo de separação aplicado aos íons) e como extrair as informações relevantes de mobilidade dos dados brutos. Este protocolo foi projetado para explicar claramente os pontos críticos de um experimento IMS/IMS e, assim, ajudar novos usuários de IMS cíclicos a realizar aquisições simples e reprodutíveis.

Introduction

A caracterização química completa das biomoléculas é fundamental para entender suas propriedades biológicas e funcionais subjacentes. Para isso, as ciências da “omics” têm se desenvolvido nos últimos anos, visando a caracterização em larga escala de estruturas químicas em concentrações biológicas. Em proteômica e metabolômica, a MS tornou-se uma ferramenta central para desvendar a heterogeneidade estrutural encontrada na mídia biológica – notadamente graças à sua sensibilidade e capacidade de fornecer informações estruturais através de tandem MS (MS/MS). Nas estratégias de MS/MS, um íon é selecionado de acordo com sua massa, depois fragmentado, e finalmente, as massas de seus fragmentos são adquiridas para estabelecer uma impressão digital da molécula. Os espectros de MS/MS podem, em particular, ser usados para combinar bancos de dados espectrais1,2 ou reconstruir provisoriamente as estruturas-mãe3,4. Sob a suposição de que espectros semelhantes pertencem a compostos semelhantes, os dados de MS/MS também podem ser usados para construir redes moleculares (MNs) conectando espécies relacionadas através de um escore de similaridade5,6.

No entanto, devido à propriedade inerente da EM para detectar a relação massa-carga (m/z) de íons, a técnica é cega para uma série de características estruturais que se enquadram na faixa do isomerismo (estéreo). Por exemplo, os carboidratos são feitos de várias subunidades de monossacarídeos, muitas das quais são estereólogos ou mesmo epimers (por exemplo, Glc vs. Gal ou Glc vs. Man). Essas subunidades estão ligadas por ligações glicosidicas, que podem diferir pela posição da ligação (regioisomerismo) e pela configuração estérica do carbono anomérico (anomerismo). Essas características dificultam a distinção entre isômeros de carboidratos7, e apenas o regioisomerismo pode ser abordado usando métodos de ativação de alta energia8,9,10. Embora a derivatização seja uma opção para interromper a equivalência de grupos estereosméricos11, requer uma preparação extensiva da amostra. Outra opção mais simples é acoplamento de ESM com uma dimensão analítica sensível ao isômerismo, como o IMS.

Como este protocolo é projetado para usuários que já estão familiarizados com os conceitos básicos do IMS, e como avaliações detalhadas estão disponíveis em outros lugares12,13, apenas uma breve visão geral dos princípios do IMS é dada aqui. IMS é um método de separação em fase de gás que se baseia na interação de íons com um gás tampão e um campo elétrico, separando íons de acordo com suas conformações de fase gasosa. Diferentes princípios do IMS acoplados à MS podem ser encontrados em instrumentos comerciais: alguns operam em campos elétricos alternados de alta e baixa (IMS assimétricos de campo, FAIMS), enquanto a maioria opera dentro do limite de campo baixo — notavelmente o tubo de deriva IMS (DTIMS, campo elétrico decrescente linear), imS de onda itinerante (TWIMS, ondas potenciais simétricas) e IMS preso (TIMS, alto fluxo de íons de captura de gás tampão contra campos elétricos)13 . Os métodos de campo baixo permitem o acesso a um chamado CCS, uma propriedade do par de gás íon que representa a superfície (em Å2 ou nm2) do íon que interage com o gás tampão durante a separação. O CCS é teoricamente independente de instrumentos e, portanto, é útil para gerar dados que podem ser reproduzidos entre diferentes laboratórios14. As separações de mobilidade de íons podem ser impactadas por vários parâmetros e, notadamente, por flutuações da pressão do gás e da temperatura do gás na célula de mobilidade. A calibração do CCS é uma forma de remediar isso, pois tanto o calibrante quanto a espécie de interesse serão igualmente afetados13. No entanto, é obrigatório instalar o instrumento em uma sala controlada pela temperatura e ter um sistema de controle de pressão de gás confiável.

Uma evolução interessante do IMS é o IMS/IMS, que foi introduzido pela primeira vez em 2006 pelo grupo de Clemmer como um analógico de MS/MS15,16. No IMS/IMS, um íon de interesse é isolado seletivamente com base em sua mobilidade de íons; em seguida, é ativado (até possível fragmentação), e uma nova análise do IMS do íon ativado ou fragmentos é realizada. No primeiro design instrumental, duas células IMS foram colocadas em série, separadas por um funil de íons onde a ativação estava. Desde então, embora uma série de configurações IMS/IMS tenham sido propostas (para revisão, consulte Eldrid e Thalassinos17), o primeiro espectrômetro de massa comercial com capacidade IMS/IMS só ficou disponível em 201918. Este instrumento melhorou substancialmente o conceito inicial, combinando-o com outro avanço tecnológico: um design cíclico da célula IMS.

A célula IMS cíclica teoricamente permite aumentar quase infinitamente o comprimento do caminho de deriva e, assim, o poder de resolução do instrumento19. Isso foi conseguido por meio de uma geometria de instrumento particular, onde a célula Cíclica TWIMS é colocada ortogonalmente ao eixo óptico de íon principal. Uma região de matriz multifuncional na entrada da célula IMS permite controlar a direção do caminho de íon: (i) enviar íons para os lados para a separação do IMS, (ii) para a frente para detecção de MS ou (iii) para trás da célula IMS a ser armazenada em uma célula de prearray. A partir desta célula de loja de prearray, os íons podem ser ativados e os fragmentos reinjetados na célula IMS para medição de mobilidade de íons, uma abordagem que tem sido usada com sucesso para caracterizar estereomers20. Em última análise, os dados coletados contêm mobilidade de íons e informações m/z para o precursor e seus fragmentos.

Em uma publicação recente que utilizou este desenho cíclico para análises glican (Ollivier et al.21), mostramos que o perfil de mobilidade dos fragmentos contidos nesses dados IMS/IMS age como uma impressão digital de uma biomolécula que pode ser usada em uma estratégia de rede molecular. A rede resultante, chamada IM-MN, levou à organização de conjuntos de dados glicômicos de forma estruturalmente relevante, enquanto a rede construída exclusivamente a partir de dados MS/MS (MS-MN) revelou poucas informações. Para complementar esta publicação e ajudar os usuários do IMS Cíclico a implementar este fluxo de trabalho, este protocolo fornece uma descrição completa do protocolo usado para coletar os dados. Este protocolo se concentra apenas na geração dos dados IMS/IMS que os usuários podem usar para criar redes IM-MN (ver21)— ou para qualquer outra aplicação de sua escolha. A construção do IM-MN não será considerada aqui, pois já existem protocolos para redes moleculares. Destacam-se os pontos cruciais que devem ser seguidos para gerar aquisições valiosas e reprodutíveis do IMS/IMS. Tomando o exemplo de um dos oligossacarídeos estudados por Ollivier et al. 21, as seguintes etapas são detalhadas: (i) preparação da amostra, (ii) ajuste do instrumento IMS Cíclico, (iii) pico automatizado de captação dos dados e (iv) calibração ccs.

Protocol

NOTA: Uma visão geral do protocolo é fornecida na Figura 1. Os parâmetros utilizados para os experimentos descritos no presente protocolo podem ser encontrados na Tabela Suplementar S1 e Tabela Suplementar S2. 1. Preparação da solução amostral NOTA: O protocolo é descrito usando um pentasacarídeo arabinoxylan (23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose ou XA2XX; veja a <str…

Representative Results

Um pentasacarídeo arabinoxylan, XA2XX, foi escolhido como exemplo para ilustrar este protocolo. Este composto está comercialmente disponível, mas apenas como uma mistura com outra pentasacarida arabinoxylan, XA3XX (XA3XX puro também está disponível comercialmente). As estruturas de XA2XX e XA3XX são dadas em Figura Suplementar S1. Como a razão de XA2XX e XA3XX na mistura comercial é ~50:50, uma solução a 20 μg/mL da …

Discussion

O SELECT SERIES Cyclic IMS é uma ferramenta poderosa que permite selecionar uma população de íons definida — de uma determinada mobilidade m/z e íon — sem a necessidade de separação cromatográfica a montante. O instrumento oferece a possibilidade de gerar um mapa de fragmentação bidimensional dessa população de íons, a partir do qual podem ser extraídos espectros de MS/MS e IMS/IMS. No entanto, o usuário deve observar vários pontos críticos que requerem atenção durante o processo experimen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.O. agradece à Agência Nacional de Pesquisa francesa por financiar seu Doutorado (conceder ANR-18-CE29-0006).

Materials

33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team – Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France – Link to an in-house R script containing a CCS calibration function
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References

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Keywords: Cyclic Ion Mobility SpectrometerTandem Ion MobilityGlycan ClassificationMolecular NetworksMass SpectrometryIon MobilityArrival TimeCalibrationAcquisition SettingsTOF ModeMSMS Mode
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Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).
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