Isolatie en karakterisering van de immuuncellen van micro-ontleedde muischoroïde plexussen
Summary
Deze studie maakt gebruik van flowcytometrie en twee verschillende gating-strategieën op geïsoleerde perfused muizen hersenen choroïde plexussen; dit protocol identificeert de belangrijkste immuuncelsubsets die deze hersenstructuur bevolken.
Abstract
De hersenen worden niet langer beschouwd als een orgaan dat geïsoleerd functioneert; accumulerend bewijs suggereert dat veranderingen in het perifere immuunsysteem indirect de hersenfunctie kunnen vormen. Op het grensvlak tussen de hersenen en de systemische circulatie zijn de choroïde plexussen (CP), die de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière vormen, gemarkeerd als een belangrijke plaats van periferie-naar-hersencommunicatie. CP produceert het hersenvocht, neurotrofe factoren en signaalmoleculen die de homeostase van de hersenen kunnen vormen. CP zijn ook een actieve immunologische niche. In tegenstelling tot het hersenparenchym, dat onder fysiologische omstandigheden voornamelijk door microglia wordt bevolkt, vat de heterogeniteit van CP-immuuncellen de diversiteit in andere perifere organen samen. De CP-immuunceldiversiteit en -activiteit veranderen met veroudering, stress en ziekte en moduleren de activiteit van het CP-epitheel, waardoor indirect de hersenfunctie wordt gevormd. Het doel van dit protocol is om murine CP te isoleren en ongeveer 90% van de belangrijkste immuunsubsets te identificeren die ze bevolken. Deze methode is een hulpmiddel om CP-immuuncellen te karakteriseren en hun functie te begrijpen bij het orkestreren van periferie-naar-hersencommunicatie. Het voorgestelde protocol kan helpen ontcijferen hoe CP-immuuncellen indirect de hersenfunctie moduleren in de gezondheid en over verschillende ziekteomstandigheden.
Introduction
Sinds de ontdekking van de bloed-hersenbarrière door Paul Erhlich in de late 19e eeuw, worden de hersenen beschouwd als vrijwel gescheiden van de andere organen en de bloedbaan. Toch is het afgelopen decennium het concept ontstaan dat de hersenfunctie wordt gevormd door verschillende biologische factoren, zoals darmmicrobiota en systemische immuuncellen en signalen1,2,3,4. Tegelijkertijd zijn andere hersengrenzen zoals hersenvliezen en choroïde plexussen (CP) geïdentificeerd als interfaces van actieve immuun-hersenkruispraat in plaats van inerte barrièreweefsels5,6,7,8.
De CP vormen de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière, een van de grenzen die de hersenen en de periferie scheiden. Ze bevinden zich in elk van de vier ventrikels van de hersenen, d.w.z. de derde, de vierde en beide laterale ventrikels, en grenzen aan gebieden die betrokken zijn bij neurogenese, zoals de subventriculaire zone en subgranulaire zone van de hippocampus3. Structureel zijn de CP samengesteld uit een netwerk van fenestrated bloedcapillairen omsloten door een monolaag van epitheelcellen, die onderling verbonden zijn door strakke en hechte juncties9,10. Belangrijke fysiologische rollen van het CP-epitheel omvatten de productie van hersenvocht, dat de hersenen spoelt uit afvalmetabolieten en eiwitaggregaten, en de productie en gecontroleerde bloed-naar-hersenpassage van verschillende signaalmoleculen, waaronder hormonen en neurotrofe factoren11,12,13. Uitgescheiden moleculen van CP vormen de activiteit van de hersenen, d.w.z. door neurogenese en microgliale functie te moduleren14,15,16,17,18,19, waardoor CP cruciaal is voor hersenhomeostase. CP houdt zich ook bezig met verschillende immuunactiviteiten; terwijl het belangrijkste immuunceltype in het hersenparenchym onder niet-pathologische omstandigheden microglia is, is de diversiteit van CP-immuuncelpopulaties net zo breed als in perifere organen3,7, wat suggereert dat verschillende kanalen van immuunregulatie en signalering aan het werk zijn bij de CP.
De ruimte tussen de endotheel- en epitheelcellen, het CP-stroma, wordt voornamelijk bevolkt door grensgeassocieerde macrofagen (BAM), die pro-inflammatoire cytokines en moleculen tot expressie brengen die verband houden met de presentatie van antigeen als reactie op ontstekingssignalen3. Een ander subtype van macrofagen, de epiplexuscellen van Kolmer, zijn aanwezig op het apicale oppervlak van het CP-epitheel20. CP stroma is ook een niche voor dendritische cellen, B-cellen, mestcellen, basofielen, neutrofielen, aangeboren lymfoïde cellen en T-cellen die meestal effectorgeheugen T-cellen zijn die antigenen van het centrale zenuwstelsel kunnen herkennen7,21,22,23,24. Bovendien verandert de samenstelling en activiteit van immuuncelpopulaties bij de CP bij systemische of hersenverstoring, bijvoorbeeld tijdens veroudering10,14,15,21,25, microbiota perturbatie7, stress26 en ziekte27,28. Met name werden deze veranderingen gesuggereerd om indirect de hersenfunctie te vormen, d.w.z. een verschuiving van CP CD4 + T-cellen naar Th2-ontsteking treedt op bij hersenveroudering en triggert immuunsignalering van de CP die verouderingsgerelateerde cognitieve achteruitgang kan vormen14,15,21,25,29 . Het verlichten van de eigenschappen van de CP-immuuncellen zou dus cruciaal zijn om hun regulerende functie op CP-epitheelfysiologie en -secretie beter te begrijpen en daardoor hun indirecte impact op de hersenfunctie onder gezonde en ziekteomstandigheden te ontcijferen.
CP zijn kleine structuren die slechts een paar immuuncellen bevatten. Hun isolatie vereist microdissectie na een voorbereidende stap van perfusie; immuuncellen in de bloedbaan zouden anders belangrijke verontreinigingen vormen. Dit protocol heeft tot doel de myeloïde en T-celsubsets van de CP te karakteriseren met behulp van flowcytometrie. Deze methode identificeert ongeveer 90% van de immuuncelpopulaties die muis-CP samenstellen onder niet-inflammatoire omstandigheden, in overeenstemming met recent gepubliceerde werken met behulp van andere methoden om immuun CP-heterogeniteit te ontleden7,10,28. Dit protocol kan worden toegepast om veranderingen in het CP-immuuncelcompartiment te karakteriseren met ziekte en andere experimentele paradigma’s in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies gericht op het begrijpen van de immunologische bijdragen aan hersenhomeostase en -ziekte hebben zich voornamelijk gericht op cellen die zich in het hersenparenchym bevinden, waarbij hersengrenzen zoals CP worden verwaarloosd, die niettemin cruciale bijdragen leveren aan de hersenfunctie2,3. De analyse van immuuncelpopulaties bij CP is een uitdaging vanwege de kleine omvang van CP, lage aantallen residente immuuncellen en gecompliceerde toegang tot dit wee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het Institut Pasteur Animalerie Centrale en de leden van de CB-UTechS-faciliteit voor hun hulp. Dit werk werd financieel ondersteund door het Institut Pasteur.
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -. W. The origin of (Kolmer’s) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain’s choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer’s disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
