Deze studie maakt gebruik van flowcytometrie en twee verschillende gating-strategieën op geïsoleerde perfused muizen hersenen choroïde plexussen; dit protocol identificeert de belangrijkste immuuncelsubsets die deze hersenstructuur bevolken.
De hersenen worden niet langer beschouwd als een orgaan dat geïsoleerd functioneert; accumulerend bewijs suggereert dat veranderingen in het perifere immuunsysteem indirect de hersenfunctie kunnen vormen. Op het grensvlak tussen de hersenen en de systemische circulatie zijn de choroïde plexussen (CP), die de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière vormen, gemarkeerd als een belangrijke plaats van periferie-naar-hersencommunicatie. CP produceert het hersenvocht, neurotrofe factoren en signaalmoleculen die de homeostase van de hersenen kunnen vormen. CP zijn ook een actieve immunologische niche. In tegenstelling tot het hersenparenchym, dat onder fysiologische omstandigheden voornamelijk door microglia wordt bevolkt, vat de heterogeniteit van CP-immuuncellen de diversiteit in andere perifere organen samen. De CP-immuunceldiversiteit en -activiteit veranderen met veroudering, stress en ziekte en moduleren de activiteit van het CP-epitheel, waardoor indirect de hersenfunctie wordt gevormd. Het doel van dit protocol is om murine CP te isoleren en ongeveer 90% van de belangrijkste immuunsubsets te identificeren die ze bevolken. Deze methode is een hulpmiddel om CP-immuuncellen te karakteriseren en hun functie te begrijpen bij het orkestreren van periferie-naar-hersencommunicatie. Het voorgestelde protocol kan helpen ontcijferen hoe CP-immuuncellen indirect de hersenfunctie moduleren in de gezondheid en over verschillende ziekteomstandigheden.
Sinds de ontdekking van de bloed-hersenbarrière door Paul Erhlich in de late 19e eeuw, worden de hersenen beschouwd als vrijwel gescheiden van de andere organen en de bloedbaan. Toch is het afgelopen decennium het concept ontstaan dat de hersenfunctie wordt gevormd door verschillende biologische factoren, zoals darmmicrobiota en systemische immuuncellen en signalen1,2,3,4. Tegelijkertijd zijn andere hersengrenzen zoals hersenvliezen en choroïde plexussen (CP) geïdentificeerd als interfaces van actieve immuun-hersenkruispraat in plaats van inerte barrièreweefsels5,6,7,8.
De CP vormen de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière, een van de grenzen die de hersenen en de periferie scheiden. Ze bevinden zich in elk van de vier ventrikels van de hersenen, d.w.z. de derde, de vierde en beide laterale ventrikels, en grenzen aan gebieden die betrokken zijn bij neurogenese, zoals de subventriculaire zone en subgranulaire zone van de hippocampus3. Structureel zijn de CP samengesteld uit een netwerk van fenestrated bloedcapillairen omsloten door een monolaag van epitheelcellen, die onderling verbonden zijn door strakke en hechte juncties9,10. Belangrijke fysiologische rollen van het CP-epitheel omvatten de productie van hersenvocht, dat de hersenen spoelt uit afvalmetabolieten en eiwitaggregaten, en de productie en gecontroleerde bloed-naar-hersenpassage van verschillende signaalmoleculen, waaronder hormonen en neurotrofe factoren11,12,13. Uitgescheiden moleculen van CP vormen de activiteit van de hersenen, d.w.z. door neurogenese en microgliale functie te moduleren14,15,16,17,18,19, waardoor CP cruciaal is voor hersenhomeostase. CP houdt zich ook bezig met verschillende immuunactiviteiten; terwijl het belangrijkste immuunceltype in het hersenparenchym onder niet-pathologische omstandigheden microglia is, is de diversiteit van CP-immuuncelpopulaties net zo breed als in perifere organen3,7, wat suggereert dat verschillende kanalen van immuunregulatie en signalering aan het werk zijn bij de CP.
De ruimte tussen de endotheel- en epitheelcellen, het CP-stroma, wordt voornamelijk bevolkt door grensgeassocieerde macrofagen (BAM), die pro-inflammatoire cytokines en moleculen tot expressie brengen die verband houden met de presentatie van antigeen als reactie op ontstekingssignalen3. Een ander subtype van macrofagen, de epiplexuscellen van Kolmer, zijn aanwezig op het apicale oppervlak van het CP-epitheel20. CP stroma is ook een niche voor dendritische cellen, B-cellen, mestcellen, basofielen, neutrofielen, aangeboren lymfoïde cellen en T-cellen die meestal effectorgeheugen T-cellen zijn die antigenen van het centrale zenuwstelsel kunnen herkennen7,21,22,23,24. Bovendien verandert de samenstelling en activiteit van immuuncelpopulaties bij de CP bij systemische of hersenverstoring, bijvoorbeeld tijdens veroudering10,14,15,21,25, microbiota perturbatie7, stress26 en ziekte27,28. Met name werden deze veranderingen gesuggereerd om indirect de hersenfunctie te vormen, d.w.z. een verschuiving van CP CD4 + T-cellen naar Th2-ontsteking treedt op bij hersenveroudering en triggert immuunsignalering van de CP die verouderingsgerelateerde cognitieve achteruitgang kan vormen14,15,21,25,29 . Het verlichten van de eigenschappen van de CP-immuuncellen zou dus cruciaal zijn om hun regulerende functie op CP-epitheelfysiologie en -secretie beter te begrijpen en daardoor hun indirecte impact op de hersenfunctie onder gezonde en ziekteomstandigheden te ontcijferen.
CP zijn kleine structuren die slechts een paar immuuncellen bevatten. Hun isolatie vereist microdissectie na een voorbereidende stap van perfusie; immuuncellen in de bloedbaan zouden anders belangrijke verontreinigingen vormen. Dit protocol heeft tot doel de myeloïde en T-celsubsets van de CP te karakteriseren met behulp van flowcytometrie. Deze methode identificeert ongeveer 90% van de immuuncelpopulaties die muis-CP samenstellen onder niet-inflammatoire omstandigheden, in overeenstemming met recent gepubliceerde werken met behulp van andere methoden om immuun CP-heterogeniteit te ontleden7,10,28. Dit protocol kan worden toegepast om veranderingen in het CP-immuuncelcompartiment te karakteriseren met ziekte en andere experimentele paradigma’s in vivo.
Studies gericht op het begrijpen van de immunologische bijdragen aan hersenhomeostase en -ziekte hebben zich voornamelijk gericht op cellen die zich in het hersenparenchym bevinden, waarbij hersengrenzen zoals CP worden verwaarloosd, die niettemin cruciale bijdragen leveren aan de hersenfunctie2,3. De analyse van immuuncelpopulaties bij CP is een uitdaging vanwege de kleine omvang van CP, lage aantallen residente immuuncellen en gecompliceerde toegang tot dit wee…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken het Institut Pasteur Animalerie Centrale en de leden van de CB-UTechS-faciliteit voor hun hulp. Dit werk werd financieel ondersteund door het Institut Pasteur.
anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
EDTA | Ion chelator | ||
fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |