В этом исследовании используется проточная цитометрия и две различные стратегии гатинга на изолированных перфузированных оболочках мозга мышей; этот протокол идентифицирует основные подмножества иммунных клеток, которые заполняют эту структуру мозга.
Мозг больше не рассматривается как орган, функционирующий изолированно; Накопленные данные свидетельствуют о том, что изменения в периферической иммунной системе могут косвенно влиять на функцию мозга. На границе между мозгом и системным кровообращением сосудисто-мозговые сплетения (CP), которые составляют барьер гематоэнцефалической жидкости, были выделены в качестве ключевого места коммуникации периферии с мозгом. CP продуцирует спинномозговую жидкость, нейротрофические факторы и сигнальные молекулы, которые могут формировать гомеостаз мозга. ХП также являются активной иммунологической нишей. В отличие от паренхимы головного мозга, которая в физиологических условиях заселяется в основном микроглией, гетерогенность иммунных клеток CP повторяет разнообразие, обнаруженное в других периферических органах. Разнообразие и активность иммунных клеток CP изменяются со старением, стрессом и болезнями и модулируют активность эпителия CP, тем самым косвенно формируя функцию мозга. Целью этого протокола является выделение мышиного ДЦП и идентификация около 90% основных иммунных подмножеств, которые их населяют. Этот метод является инструментом для характеристики иммунных клеток CP и понимания их функции в организации коммуникации периферии с мозгом. Предлагаемый протокол может помочь расшифровать, как иммунные клетки CP косвенно модулируют функцию мозга в здоровье и при различных заболеваниях.
С момента открытия гематоэнцефалического барьера Полом Эрлихом в конце 19-го века мозг считался практически отделенным от других органов и кровотока. Тем не менее, в последнее десятилетие появилась концепция о том, что функция мозга формируется различными биологическими факторами, такими как микробиота кишечника и системные иммунные клетки и сигналы1,2,3,4. Параллельно другие границы мозга, такие как мозговые оболочки и сосудисто-сросшиеся соединения (CP), были идентифицированы как интерфейсы активного перекрестного разговора между иммунитетом и мозгом, а не инертные барьерные ткани5,6,7,8.
ДЦП составляют гематоэнцефалический барьер жидкости, одну из границ, разделяющих мозг и периферию. Они расположены в каждом из четырех желудочков головного мозга, то есть в третьем, четвертом и обоих боковых желудочках, и примыкают к областям, участвующим в нейрогенезе, таким как субвентрикулярная зона и субгранулярная зона гиппокампа3. Структурно ХП состоят из сети фенестрированных кровеносных капилляров, заключенных монослоем эпителиальных клеток, которые соединены между собой плотными и адгезионными соединениями9,10. Основные физиологические роли эпителия CP включают производство спинномозговой жидкости, которая смывает мозг из отходов метаболитов и белковых агрегатов, а также производство и контролируемое прохождение кровью в мозг различных сигнальных молекул, включая гормоны и нейротрофические факторы11,12,13. Секретируемые молекулы из CP формируют активность мозга, то есть модулируя нейрогенез и функцию микроглии14,15,16,17,18,19, что делает CP критически важным для гомеостаза мозга. ХП также участвуют в различных иммунных действиях; в то время как основным типом иммунных клеток в паренхиме головного мозга при непатологических состояниях является микроглия, разнообразие популяций иммунных клеток CP столь же широко, как и в периферических органах3,7, что позволяет предположить, что на ДЦП работают различные каналы иммунной регуляции и передачи сигналов.
Пространство между эндотелиальными и эпителиальными клетками, строма CP, в основном заполнено погранично-ассоциированными макрофагами (BAM), которые экспрессируют провоспалительные цитокины и молекулы, связанные с презентацией антигена в ответ на воспалительные сигналы3. Другой подтип макрофагов, эпиплексические клетки Колмера, присутствуют на апикальной поверхности CP epithelium20. CP stroma также является нишей для дендритных клеток, В-клеток, тучных клеток, базофилов, нейтрофилов, врожденных лимфоидных клеток и Т-клеток, которые в основном являются эффекторными Т-клетками памяти, способными распознавать антигены центральной нервной системы7,21,22,23,24. Кроме того, состав и активность популяций иммунных клеток при ДЦП изменяется при системном или мозговом возмущении, например, при старении 10,14,15,21,25, возмущении микробиоты7, стрессе26 и болезни27,28. Примечательно, что эти изменения были предложены для косвенного формирования функции мозга, то есть сдвиг CP CD4 + Т-клеток в сторону воспаления Th2 происходит при старении мозга и вызывает иммунную сигнализацию от CP, которая может формировать связанное со старением снижение когнитивных функций14,15,21,25,29 . Таким образом, освещение свойств иммунных клеток CP будет иметь решающее значение для лучшего понимания их регуляторной функции по физиологии и секреции эпителия CP и, таким образом, расшифровки их косвенного воздействия на функцию мозга в здоровых и болезнетворных условиях.
CP представляют собой небольшие структуры, которые содержат только несколько иммунных клеток. Их выделение требует микродиссекции после предварительного этапа перфузии; Иммунные клетки в кровотоке в противном случае представляли бы собой основные загрязняющие вещества. Этот протокол направлен на характеристику подмножеств миелоидных и Т-клеток CP с использованием проточной цитометрии. Этот метод идентифицирует около 90% популяций иммунных клеток, которые составляют ХП мышей при невоспалительных состояниях, в соответствии с недавно опубликованными работами с использованием других методов диссекции иммунной гетерогенности ДЦП7,10,28. Этот протокол может быть применен для характеристики изменений в компартменте иммунных клеток CP с заболеванием и другими экспериментальными парадигмами in vivo.
Исследования, направленные на понимание иммунологического вклада в гомеостаз мозга и болезни, в основном сосредоточены на клетках, находящихся в паренхиме мозга, пренебрегая границами мозга, такими как CP, которые, тем не менее, являются решающими факторами функции мозга2,3<…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Institut Pasteur Animalerie Centrale и членов CB-UTechS за их помощь. Эта работа была финансово поддержана Институтом Пастера.
anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
EDTA | Ion chelator | ||
fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |