Выделение и характеристика иммунных клеток из микрорасчлененных мышиных сосудисто-мозговых сплетений
Summary
В этом исследовании используется проточная цитометрия и две различные стратегии гатинга на изолированных перфузированных оболочках мозга мышей; этот протокол идентифицирует основные подмножества иммунных клеток, которые заполняют эту структуру мозга.
Abstract
Мозг больше не рассматривается как орган, функционирующий изолированно; Накопленные данные свидетельствуют о том, что изменения в периферической иммунной системе могут косвенно влиять на функцию мозга. На границе между мозгом и системным кровообращением сосудисто-мозговые сплетения (CP), которые составляют барьер гематоэнцефалической жидкости, были выделены в качестве ключевого места коммуникации периферии с мозгом. CP продуцирует спинномозговую жидкость, нейротрофические факторы и сигнальные молекулы, которые могут формировать гомеостаз мозга. ХП также являются активной иммунологической нишей. В отличие от паренхимы головного мозга, которая в физиологических условиях заселяется в основном микроглией, гетерогенность иммунных клеток CP повторяет разнообразие, обнаруженное в других периферических органах. Разнообразие и активность иммунных клеток CP изменяются со старением, стрессом и болезнями и модулируют активность эпителия CP, тем самым косвенно формируя функцию мозга. Целью этого протокола является выделение мышиного ДЦП и идентификация около 90% основных иммунных подмножеств, которые их населяют. Этот метод является инструментом для характеристики иммунных клеток CP и понимания их функции в организации коммуникации периферии с мозгом. Предлагаемый протокол может помочь расшифровать, как иммунные клетки CP косвенно модулируют функцию мозга в здоровье и при различных заболеваниях.
Introduction
С момента открытия гематоэнцефалического барьера Полом Эрлихом в конце 19-го века мозг считался практически отделенным от других органов и кровотока. Тем не менее, в последнее десятилетие появилась концепция о том, что функция мозга формируется различными биологическими факторами, такими как микробиота кишечника и системные иммунные клетки и сигналы1,2,3,4. Параллельно другие границы мозга, такие как мозговые оболочки и сосудисто-сросшиеся соединения (CP), были идентифицированы как интерфейсы активного перекрестного разговора между иммунитетом и мозгом, а не инертные барьерные ткани5,6,7,8.
ДЦП составляют гематоэнцефалический барьер жидкости, одну из границ, разделяющих мозг и периферию. Они расположены в каждом из четырех желудочков головного мозга, то есть в третьем, четвертом и обоих боковых желудочках, и примыкают к областям, участвующим в нейрогенезе, таким как субвентрикулярная зона и субгранулярная зона гиппокампа3. Структурно ХП состоят из сети фенестрированных кровеносных капилляров, заключенных монослоем эпителиальных клеток, которые соединены между собой плотными и адгезионными соединениями9,10. Основные физиологические роли эпителия CP включают производство спинномозговой жидкости, которая смывает мозг из отходов метаболитов и белковых агрегатов, а также производство и контролируемое прохождение кровью в мозг различных сигнальных молекул, включая гормоны и нейротрофические факторы11,12,13. Секретируемые молекулы из CP формируют активность мозга, то есть модулируя нейрогенез и функцию микроглии14,15,16,17,18,19, что делает CP критически важным для гомеостаза мозга. ХП также участвуют в различных иммунных действиях; в то время как основным типом иммунных клеток в паренхиме головного мозга при непатологических состояниях является микроглия, разнообразие популяций иммунных клеток CP столь же широко, как и в периферических органах3,7, что позволяет предположить, что на ДЦП работают различные каналы иммунной регуляции и передачи сигналов.
Пространство между эндотелиальными и эпителиальными клетками, строма CP, в основном заполнено погранично-ассоциированными макрофагами (BAM), которые экспрессируют провоспалительные цитокины и молекулы, связанные с презентацией антигена в ответ на воспалительные сигналы3. Другой подтип макрофагов, эпиплексические клетки Колмера, присутствуют на апикальной поверхности CP epithelium20. CP stroma также является нишей для дендритных клеток, В-клеток, тучных клеток, базофилов, нейтрофилов, врожденных лимфоидных клеток и Т-клеток, которые в основном являются эффекторными Т-клетками памяти, способными распознавать антигены центральной нервной системы7,21,22,23,24. Кроме того, состав и активность популяций иммунных клеток при ДЦП изменяется при системном или мозговом возмущении, например, при старении 10,14,15,21,25, возмущении микробиоты7, стрессе26 и болезни27,28. Примечательно, что эти изменения были предложены для косвенного формирования функции мозга, то есть сдвиг CP CD4 + Т-клеток в сторону воспаления Th2 происходит при старении мозга и вызывает иммунную сигнализацию от CP, которая может формировать связанное со старением снижение когнитивных функций14,15,21,25,29 . Таким образом, освещение свойств иммунных клеток CP будет иметь решающее значение для лучшего понимания их регуляторной функции по физиологии и секреции эпителия CP и, таким образом, расшифровки их косвенного воздействия на функцию мозга в здоровых и болезнетворных условиях.
CP представляют собой небольшие структуры, которые содержат только несколько иммунных клеток. Их выделение требует микродиссекции после предварительного этапа перфузии; Иммунные клетки в кровотоке в противном случае представляли бы собой основные загрязняющие вещества. Этот протокол направлен на характеристику подмножеств миелоидных и Т-клеток CP с использованием проточной цитометрии. Этот метод идентифицирует около 90% популяций иммунных клеток, которые составляют ХП мышей при невоспалительных состояниях, в соответствии с недавно опубликованными работами с использованием других методов диссекции иммунной гетерогенности ДЦП7,10,28. Этот протокол может быть применен для характеристики изменений в компартменте иммунных клеток CP с заболеванием и другими экспериментальными парадигмами in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследования, направленные на понимание иммунологического вклада в гомеостаз мозга и болезни, в основном сосредоточены на клетках, находящихся в паренхиме мозга, пренебрегая границами мозга, такими как CP, которые, тем не менее, являются решающими факторами функции мозга2,3<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Institut Pasteur Animalerie Centrale и членов CB-UTechS за их помощь. Эта работа была финансово поддержана Институтом Пастера.
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -. W. The origin of (Kolmer’s) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain’s choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer’s disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
