مفاعل حيوي موجه بالتصوير لتوليد أنسجة مجرى الهواء المهندسة بيولوجيا
Summary
يصف البروتوكول مفاعلا حيويا ممكنا للتصوير يسمح بالإزالة الانتقائية للظهارة الداخلية من القصبة الهوائية للفئران والتوزيع المتجانس للخلايا الخارجية على سطح التجويف ، يليه زراعة طويلة الأجل في المختبر لبناء أنسجة الخلية.
Abstract
يمكن أن تؤدي الإصابة المتكررة لأنسجة مجرى الهواء إلى إضعاف وظائف الرئة والتسبب في أمراض الرئة المزمنة، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن. يوفر التقدم في الطب التجديدي وتقنيات المفاعلات الحيوية فرصا لإنتاج أنسجة وظيفية مزروعة في المختبر وهياكل الأعضاء التي يمكن استخدامها لفحص الأدوية ونمذجة الأمراض وهندسة استبدال الأنسجة. هنا ، يتم وصف مفاعل حيوي مصغر مقترن بطريقة تصوير تسمح في الموقع بتصور التجويف الداخلي للقصبة الهوائية للفئران المسحوبة أثناء التلاعب بالأنسجة في المختبر والزراعة. باستخدام هذا المفاعل الحيوي ، يوضح البروتوكول الإزالة الانتقائية الموجهة بالتصوير للمكونات الخلوية الداخلية مع الحفاظ على الميزات الكيميائية الحيوية الجوهرية والبنية الفائقة لمصفوفة أنسجة مجرى الهواء. علاوة على ذلك ، يتم عرض التسليم والتوزيع الموحد والاستزراع المطول اللاحق للخلايا الخارجية على تجويف مجرى الهواء الخالي من الخلايا مع المراقبة البصرية في الموقع . وتسلط النتائج الضوء على أنه يمكن استخدام المفاعل الحيوي الموجه بالتصوير لتسهيل توليد أنسجة مجرى الهواء الوظيفية في المختبر .
Introduction
يصطف السطح المضيء للجهاز التنفسي بطبقة من الظهارة تتكون أساسا من الخلايا الجذعية متعددة الأهداب والنادي والكأس والخلايا الجذعية القاعدية 1,2. تعمل الطبقة الظهارية كآلية دفاعية أولية للرئة ، حيث تعمل كحاجز فيزيائي حيوي يحمي أنسجة مجرى الهواء الأساسي من مسببات الأمراض المستنشقة أو الجسيمات أو الغازات الكيميائية. يحمي أنسجة مجرى الهواء عبر آليات متعددة ، بما في ذلك تكوين تقاطع ضيق بين الخلايا ، وإزالة الغشاء المخاطي الهدبي ، وإفراز مضادات الميكروبات ومضادات الأكسدة 3,4. ترتبط ظهارة مجرى الهواء المعيبة بأمراض الجهاز التنفسي المدمرة، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)5، وخلل الحركة الهدبية الأولية (PCD)6، والتليف الكيسي (CF)7.
يمثل التقدم في تكنولوجيا الرئة على الرقاقة (LOC) فرصة لدراسة تطور الرئة البشرية ، ونمذجة أمراض الرئة المختلفة ، وتطوير مواد علاجية جديدة في بيئات مختبرية منظمة بإحكام. على سبيل المثال ، يمكن استزراع ظهارة مجرى الهواء والبطانة على الجانبين المتقابلين من غشاء رقيق مسامي لتقليد الغاز الذي يتبادل أنسجة الرئة ، مما يسمح بنمذجة الأمراض المخلصة واختبار الأدوية8. وبالمثل ، تم إنشاء نماذج الأمراض في المختبر لنمذجة أمراض مجرى الهواء في المختبر ، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن9 والتليف الكيسي10. ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي لأجهزة LOC هو تلخيص البنية المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) لأنسجة الرئة وتفاعلات مصفوفة الأنسجة الخلوية الديناميكية في المختبر11.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير منهجيات هندسة الأنسجة المبتكرة التي تسمح بالتلاعب بأنسجة الرئة خارج الجسم الحي 12. باستخدام هذه المنهجيات ، يمكن تحضير طعوم الأنسجة الخالية أو الغريبة عن طريق إزالة الخلايا الداخلية من أنسجة الرئة عن طريق العلاجات الكيميائية والفيزيائية والميكانيكية13. بالإضافة إلى ذلك ، توفر مصفوفة الأنسجة الأصلية خارج الخلية المحفوظة (ECM) في سقالات الرئة المنزوعة الخلايا الإشارات الهيكلية والكيميائية الحيوية والميكانيكية الحيوية للخلايا المزروعة لربط وتكاثر وتمييز14,15.
هنا ، يتم الإبلاغ عن نظام مفاعل حيوي موجه بالتصوير تم إنشاؤه من خلال الجمع بين تقنيات LOC وهندسة الأنسجة للسماح في المختبر بمعالجة الأنسجة وزراعة أنسجة القصبة الهوائية للفئران المزروعة. باستخدام هذا المفاعل الحيوي لأنسجة مجرى الهواء ، يوضح البروتوكول الإزالة الانتقائية للخلايا الظهارية الداخلية دون تعطيل المكونات الخلوية والكيميائية الحيوية تحت الظهارية الأساسية لأنسجة مجرى الهواء. نعرض بعد ذلك التوزيع المتجانس والترسب الفوري للخلايا الخارجية المبذرة حديثا ، مثل الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، على تجويف مجرى الهواء العارية عن طريق غرس محلول الكولاجين I المحمل بالخلية I قبل الهلام. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام جهاز التصوير الضوئي الدقيق المدمج في المفاعل الحيوي ، يتم أيضا تصور تجويف القصبة الهوائية أثناء إزالة الظهارة وتوصيل الخلايا الذاتية. علاوة على ذلك ، تبين أنه يمكن زراعة القصبة الهوائية والخلايا المزروعة حديثا في المفاعل الحيوي دون موت ملحوظ للخلايا وتدهور الأنسجة لمدة 4 أيام. نحن نتصور أن منصة المفاعل الحيوي التي تدعم التصوير ، وتقنية إزالة الظهارة القائمة على الأغشية الرقيقة ، وطريقة توصيل الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة يمكن أن تكون مفيدة لتوليد أنسجة مجرى الهواء لنمذجة الأمراض في المختبر وفحص الأدوية.
يتضمن المفاعل الحيوي غرفة مستطيلة متصلة بمضخة حقنة قابلة للبرمجة ومضخة تروية وجهاز تهوية لزراعة القصبة الهوائية للفئران المعزولة. يتميز المفاعل الحيوي بمداخل ومنافذ متصلة بالقصبة الهوائية أو غرفة زراعة الأنسجة لتزويد الكواشف بشكل منفصل (مثل وسائط الاستزراع) بالمساحات الداخلية والخارجية للقصبة الهوائية (الشكل 1). يمكن استخدام نظام تصوير مصمم خصيصا لتصور الجزء الداخلي من القصبة الهوائية للفئران المستزرعة في المختبر على المستوى الخلوي (الشكل 2). تتم إزالة الظهارة الداخلية للقصبة الهوائية عن طريق تقطير محلول إزالة الخلايا القائم على المنظفات يليه غسل مجرى الهواء بمساعدة الاهتزاز (الشكل 3). يستخدم محلول الهيدروجيل ، مثل الكولاجين من النوع الأول ، كوسيلة توصيل لبذر الخلايا الخارجية بشكل موحد وفوري عبر تجويف القصبة الهوائية العارية (الشكل 4). يتم توفير جميع المواد المستخدمة لبناء المفاعل الحيوي وإجراء التجارب في جدول المواد.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل ، أنشأنا مفاعلا حيويا موجها بالتصوير يمكن أن يسمح (i) بمراقبة تجويف القصبة الهوائية في الموقع بعد إزالة الخلية وتوصيل الخلايا الخارجية و (ii) على المدى الطويل في المختبر لأنسجة القصبة الهوائية المزروعة بالخلايا. باستخدام هذا المفاعل الحيوي المصمم خصيصا ، أظهرنا (i) الإ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج أبحاث مؤسسة جمعية الصدر الأمريكية ، ومؤسسة نيو جيرسي الصحية ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (جائزة CAREER 2143620) إلى J.K. ؛ والمعاهد الوطنية للصحة (P41 EB027062) إلى G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
- Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
- Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
- De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
- Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
- Planchard, D. . Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).
- Coward, C. . A Beginner’s Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).
- Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. . 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
- O’Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
- Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
- O’Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
- Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
- Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).
