Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias
Summary
El protocolo describe un biorreactor habilitado para imágenes que permite la eliminación selectiva del epitelio endógeno de la tráquea de la rata y la distribución homogénea de las células exógenas en la superficie de la luz, seguido de un cultivo in vitro a largo plazo de la construcción célula-tejido.
Abstract
La lesión repetida del tejido de las vías respiratorias puede afectar la función pulmonar y causar enfermedad pulmonar crónica, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Los avances en medicina regenerativa y tecnologías de biorreactores ofrecen oportunidades para producir tejidos funcionales cultivados en laboratorio y construcciones de órganos que se pueden usar para detectar medicamentos, modelar enfermedades y diseñar reemplazos de tejidos. Aquí, se describe un biorreactor miniaturizado junto con una modalidad de imagen que permite la visualización in situ de la luz interna de la tráquea de rata explantada durante la manipulación y el cultivo de tejidos in vitro . Utilizando este biorreactor, el protocolo demuestra la eliminación selectiva guiada por imágenes de componentes celulares endógenos al tiempo que preserva las características bioquímicas intrínsecas y la ultraestructura de la matriz de tejido de las vías respiratorias. Además, se muestra la entrega, distribución uniforme y posterior cultivo prolongado de células exógenas en la luz de la vía aérea descelularizada con monitorización óptica in situ . Los resultados destacan que el biorreactor guiado por imágenes se puede utilizar potencialmente para facilitar la generación de tejidos funcionales in vitro de las vías respiratorias.
Introduction
La superficie luminal del tracto respiratorio está revestida por una capa de epitelio que consiste principalmente en células madre multiciliadas, garrote, copa ybasales 1,2. La capa epitelial sirve como un mecanismo de defensa primario del pulmón, actuando como una barrera biofísica que protege el tejido subyacente de las vías respiratorias contra patógenos inhalados, partículas o gases químicos. Protege el tejido de las vías respiratorias a través de múltiples mecanismos, incluida la formación de uniones estrechas intercelulares, el aclaramiento mucociliar y la secreción antimicrobiana y antioxidante 3,4. El epitelio defectuoso de las vías respiratorias se asocia con enfermedades respiratorias devastadoras, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)5, la discinesia ciliar primaria (PCD)6 y la fibrosis quística (FQ)7.
Los avances en la tecnología lung-on-chip (LOC) representan una oportunidad para estudiar el desarrollo pulmonar humano, modelar diversas enfermedades pulmonares y desarrollar nuevos materiales terapéuticos en entornos in vitro estrechamente regulados. Por ejemplo, el epitelio y el endotelio de las vías respiratorias se pueden cultivar en lados opuestos de una membrana delgada y porosa para imitar el tejido pulmonar que intercambia gases, lo que permite un modelado fiel de la enfermedad y pruebas de drogas8. Del mismo modo, se han creado modelos de enfermedades in vitro para modelar enfermedades de las vías respiratorias in vitro, como la EPOC9 y la fibrosis quística10. Sin embargo, un desafío importante de los dispositivos LOC es recapitular la compleja arquitectura tridimensional (3D) del tejido pulmonar y las interacciones dinámicas de la matriz célula-tejido in vitro11.
Recientemente, se han desarrollado metodologías innovadoras de ingeniería de tejidos que permiten la manipulación de tejidos pulmonares ex vivo 12. Utilizando estas metodologías, se pueden preparar injertos de tejido alogénico o xenogénico desnudo mediante la eliminación de las células endógenas del tejido pulmonar a través de tratamientos químicos, físicos y mecánicos13. Además, la matriz extracelular (ECM) de tejido nativo preservado en los andamios pulmonares descelularizados proporciona las señales estructurales, bioquímicas y biomecánicas fisio-miméticas para que las células implantadas se adhieran, proliferen y diferencien14,15.
Aquí, se informa de un sistema de biorreactor guiado por imágenes creado mediante la combinación de LOC y tecnologías de ingeniería de tejidos para permitir la manipulación y el cultivo de tejidos traqueales de ratas explantados. Utilizando este biorreactor de tejido de las vías respiratorias, el protocolo demuestra la eliminación selectiva de las células epiteliales endógenas sin interrumpir los componentes celulares y bioquímicos subepiteliales subyacentes del tejido de las vías respiratorias. A continuación, mostramos la distribución homogénea y la deposición instantánea de las células exógenas recién sembradas, como las células madre mesenquimales (MSC), en la luz de las vías respiratorias desnudas mediante la inculcación de la solución pre-gel de colágeno I cargada de células. Además, mediante el uso del dispositivo de imagen microóptica integrado en el biorreactor, también se realiza la visualización de la luz de la tráquea durante la eliminación del epitelio y la administración endógena de células. Además, se demuestra que la tráquea y las células recién implantadas se pueden cultivar en el biorreactor sin muerte celular notable y degradación tisular durante 4 días. Prevemos que la plataforma de biorreactores habilitada para imágenes, la técnica de deseptelización basada en película delgada y el método de administración celular utilizado en este estudio pueden ser útiles para generar tejidos de las vías respiratorias para el modelado de enfermedades in vitro y la detección de fármacos.
El biorreactor incluye una cámara rectangular conectada a una bomba de jeringa programable, una bomba de perfusión y un ventilador para el cultivo de tráquea de rata aislada. El biorreactor cuenta con entradas y salidas conectadas a la tráquea o a la cámara de cultivo de tejidos para suministrar por separado reactivos (por ejemplo, medios de cultivo) a los espacios internos y externos de la tráquea (Figura 1). Se puede utilizar un sistema de imágenes personalizado para visualizar el interior de la tráquea de rata cultivada in vitro a nivel celular (Figura 2). El epitelio endógeno de la tráquea se elimina mediante la instilación de una solución de descelularización a base de detergente seguida de un lavado de las vías respiratorias asistido por vibración (Figura 3). La solución de hidrogel, como el colágeno tipo I, se utiliza como vehículo de entrega para sembrar células exógenas de manera uniforme e instantánea a través de la luz de la tráquea desnuda (Figura 4). Todos los materiales utilizados para construir el biorreactor y realizar los experimentos se proporcionan en la Tabla de Materiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, creamos un biorreactor guiado por imágenes que puede permitir (i) el monitoreo de la luz de la tráquea in situ después de la eliminación celular y la entrega de células exógenas y (ii) el cultivo in vitro a largo plazo del tejido de la tráquea con semilla celular. Utilizando este biorreactor personalizado, demostramos (i) la eliminación selectiva de las células epiteliales endógenas de la luz de la tráquea utilizando detergente y lavado de las vías respiratorias asistido por…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación ha sido apoyada en parte por el Programa de Investigación de la Fundación de la Sociedad Torácica Americana, la Fundación de Salud de Nueva Jersey y la Fundación Nacional de Ciencias (Premio CAREER 2143620) a J.K.; y los Institutos Nacionales de Salud (P41 EB027062) a G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
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