הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן
Summary
הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) של פיזור קדם-תהודה אלקטרונית של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן היא פלטפורמה חדשה להדמיית חלבונים מבוססת אפיטופים מרובבים מאוד. כאן אנו מציגים מדריך מעשי הכולל הכנת נוגדנים, צביעת דגימת רקמות, הרכבת מיקרוסקופ SRS והדמיית רקמות epr-SRS.
Abstract
הדמיה של היקף עצום של סמנים ביולוגיים ספציפיים ברקמות ממלאת תפקיד חיוני בחקר הארגונים המורכבים של מערכות ביולוגיות מורכבות. לפיכך, טכנולוגיות הדמיה מרובות מאוד זכו להערכה הולכת וגוברת. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מתפתחת של הדמיה ויברציונית מרובבת מאוד של חלבונים ספציפיים עם רגישות דומה לאימונופלואורסצנציה סטנדרטית באמצעות הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) אלקטרונית המעוררת בתהודה מוקדמת של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן. שיטה זו עוקפת את הגבול של תעלות הניתנות לפתרון ספקטרלי באימונופלואורסצנציה קונבנציונלית ומספקת גישה אופטית של ירייה אחת כדי לחקור סמנים מרובים ברקמות עם רזולוציה תת-תאית. הוא תואם בדרך כלל לתכשירי רקמות סטנדרטיים, כולל רקמות קבועות פרפורמלדהיד, רקמות קפואות ורקמות אנושיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). אנו צופים שפלטפורמה זו תספק תמונה מקיפה יותר של אינטראקציות חלבונים של דגימות ביולוגיות, במיוחד עבור רקמות שלמות ועבות. פרוטוקול זה מספק את זרימת העבודה מהכנת נוגדנים להכתמת דגימת רקמות, להרכבת מיקרוסקופ SRS, להדמיית רקמות epr-SRS.
Introduction
מערכות רקמות מורכבות מורכבות מתת-אוכלוסיות תאיות נפרדות שמיקומיהן המרחביים ורשתות האינטראקציה שלהן שזורים עמוק בתפקודים ובתפקוד לקוי שלהן 1,2. כדי לחשוף את ארכיטקטורת הרקמה ולחקור את המורכבות שלה, ידע על המיקומים המרחביים של חלבונים ברזולוציה של תא יחיד הוא חיוני. לפיכך, טכנולוגיות הדמיית חלבונים מרובות מאוד זכו להערכה הולכת וגוברת ויכולות להפוך לאבן פינה לחקר הביולוגיה של הרקמות 3,4,5. ניתן לסווג את שיטות ההדמיה הנפוצות הנוכחיות של חלבונים מרובבים לשתי קטגוריות עיקריות. האחת היא הדמיה אימונופלואורסצנטית סדרתית המסתמכת על סבבים מרובים של צביעת רקמות והדמיה, והשנייה היא הדמיית ציטומטריה המונית בשילוב עם נוגדנים מתויגים במתכת כבדה 6,7,8,9,10,11,12.
כאן מוצגת אסטרטגיה חלופית להדמיית חלבונים מבוססי נוגדנים מרובבים. בניגוד לשיטת ההדמיה הפלואורסצנטית הנפוצה, שיכולה לדמיין רק 4-5 ערוצים בו זמנית בשל ספקטרום העירור והפליטה הרחב (רוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM) ~ 500 ס”מ-1), מיקרוסקופיית ראמאן מציגה קו ספקטרלי צר בהרבה (FWHM ~ 10 cm-1) ולכן מספקת ריבוי מדרגי. לאחרונה, על ידי רתימת הספקטרום הצר, פותחה תוכנית חדשנית של מיקרוסקופיית ראמאן בשם מיקרוסקופיית קדם-תהודה אלקטרונית מגורה פיזור ראמאן (epr-SRS), המספקת אסטרטגיה רבת עוצמה להדמיה מרובבת13. על-ידי חקירת מצבי הרטט המצומדים אלקטרונית של צבעי ראמאן, epr-SRS משיג אפקט שיפור דרסטי של פי 1013 על חתכי ראמאן ומתגבר על צוואר הבקבוק הרגיש של מיקרוסקופיית ראמאן קונבנציונלית (איור 1A)13,14,15. כתוצאה מכך, גבול הגילוי של epr-SRS נדחף לתת-μM, מה שמאפשר זיהוי ראמאן של סמנים מולקולריים מעניינים כגון חלבונים ואברונים ספציפיים בתוך תאים13,16. בפרט, תוך שימוש בנוגדנים מצומדים לצבעי ראמאן, הדמיית epr-SRS של חלבונים ספציפיים בתאים וברקמות (הנקראת immuno-eprSRS) הודגמה ברגישות דומה לאימונופלואורסצנציה סטנדרטית (איור 1B)13,17. על-ידי כוונון אורך הגל של המשאבה ב-2 ננומטר בלבד, אות ה-epr-SRS יהיה כבוי לחלוטין (איור 1B), המציג ניגודיות רטט גבוהה.
בצד הגשושית, פותחה קבוצה של גשושיות ראמאן דמויות קשת בשם צבעי פיזור מנהטן ראמאן (MARS) להצמדת נוגדנים 13,18,19,20. פלטת ראמאן ייחודית זו מורכבת מצבעים חדשניים הנושאים קשרים משולשים מצומדים π (חומר משלים), שכל אחד מהם מציג שיא epr-SRS יחיד וצר בטווח הספקטרלי הביו-אורתוגונלי של ראמאן (איור 1C). על ידי שינוי המבנה של כרומופור הליבה ועריכה איזוטופית של שני האטומים של הקשר המשולש (חומר משלים), פותחו גשושיות ראמאן מופרדות ספקטרלית. תוך מינוף המולטיפלקסיות הניתנות להרחבה, מיקרוסקופיית epr-SRS בשילוב עם פלטת הצבעים MARS מציעים אסטרטגיה אופטית להדמיית חלבונים מולטיפלקס בצילום אחד בתאים וברקמות.
Immuno-eprSRS מספק אסטרטגיה חלופית לשיטות הדמיית חלבוני המולטיפלקס הנוכחיות עם חוזקות ייחודיות. בהשוואה לגישות פלואורסצנטיות עם צביעה מחזורית, הדמיה והסרת אותות, פלטפורמה מבוססת ראמאן זו מבטיחה צביעה והדמיה של סיבוב יחיד. לכן, הוא עוקף את המורכבות המעשית בהליכים מחזוריים ובמידה רבה מפשט את הפרוטוקול, ומכאן פותח טריטוריות חדשות של הדמיית חלבונים מרובבים. לדוגמה, רתימת פרוטוקול ניקוי רקמות המותאם לצבע ראמן, immuno-eprSRS הורחב לשלושה ממדים למיפוי חלבונים מרובב מאוד ברקמות עבות שלמות17. יותר מ-10 מטרות חלבונים צולמו לאורך רקמות מוח של עכברים בעובי מילימטר17. לאחרונה,הודגם גם צימוד אימונו-eprSRS עם פרוטוקול מיקרוסקופיית הרחבה אופטימלית לשימור ביו-מולקולות (ExM)21, הדמיה בקנה מידה ננומטרי של ירייה אחת של מטרות מרובות. בהשוואה לספקטרוסקופיית מסות הדמיה 4,9, epr-SRS הוא לא-דיסטרוקטיבי ובעל יכולת חתך אופטית פנימית. יתר על כן, epr-SRS יעיל יותר בזמן בסריקת רקמות. בדרך כלל, אזור רקמה של 0.25 מ”מ2 עם גודל פיקסל של 0.5 מיקרומטר לוקח רק כמה דקות כדי לצלם עבור ערוץ epr-SRS יחיד. לדוגמה, זמן ההדמיה הכולל של ארבעה ערוצי SRS ועוד ארבעה ערוצים פלואורסצנטיים באיור 4 הוא בערך 10 דקות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים את פרוטוקול immuno-eprSRS אשר ישים באופן נרחב לסוגי רקמות נפוצים, כולל רקמות עכברים שזה עתה השתמרו, רקמות אנושיות FFPE ורקמות עכבר קפואות. Immuno-eprSRS אומת עבור פאנל של אפיטופים בתאים וברקמות, כמפורט בטבלה 1. פלטפורמה זו של ירייה אחת מתאימה במיוחד ליישומים שבהם אסטרטגיות מחזורי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לרות א. סינגר ולריצ’רד ק.פ. באנינגר על אספקת רקמות הלבלב של העכבר. W.M. מכיר בתמיכה של NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) וצבא ארה”ב (W911NF-19-1-0214).
Materials
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
- Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
- Lin, J. -. R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657 (2018).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544, 465 (2017).
- Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
- Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
- Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
- Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
- Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).
- Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).
- Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).
- Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
- Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
- Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537 (2018).
- Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- . Coherent Raman Scattering Microscope Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022)
