Elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen is een nieuw platform voor sterk gemultiplexte epitoop-gebaseerde eiwitbeeldvorming. Hier presenteren we een praktische gids met antilichaamvoorbereiding, weefselmonsterkleuring, SRS-microscoopassemblage en epr-SRS-weefselbeeldvorming.
Het visualiseren van een breed scala aan specifieke biomarkers in weefsels speelt een vitale rol bij het verkennen van de ingewikkelde organisaties van complexe biologische systemen. Vandaar dat sterk gemultiplexte beeldvormingstechnologieën steeds meer worden gewaardeerd. Hier beschrijven we een opkomend platform van sterk gemultiplexte vibrationele beeldvorming van specifieke eiwitten met vergelijkbare gevoeligheid voor standaard immunofluorescentie via elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen. Deze methode omzeilt de limiet van spectraal oplosbare kanalen in conventionele immunofluorescentie en biedt een one-shot optische benadering om meerdere markers in weefsels met subcellulaire resolutie te ondervragen. Het is over het algemeen compatibel met standaard weefselpreparaten, waaronder paraformaldehyde-gefixeerde weefsels, bevroren weefsels en formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) menselijke weefsels. We verwachten dat dit platform een uitgebreider beeld zal geven van eiwitinteracties van biologische specimens, met name voor dikke intacte weefsels. Dit protocol biedt de workflow van antilichaamvoorbereiding tot weefselmonsterkleuring, tot SRS-microscoopassemblage, tot epr-SRS-weefselbeeldvorming.
Complexe weefselsystemen zijn samengesteld uit verschillende cellulaire subpopulaties waarvan de ruimtelijke locaties en interactienetwerken diep verweven zijn met hun functies en disfuncties 1,2. Om de weefselarchitectuur te onthullen en de complexiteit ervan te ondervragen, is kennis van de ruimtelijke locaties van eiwitten met eencellige resolutie essentieel. Vandaar dat sterk gemultiplexte eiwitbeeldvormingstechnologieën steeds meer worden gewaardeerd en een hoeksteen kunnen worden voor het bestuderen van weefselbiologie 3,4,5. De huidige gangbare multiplexed eiwitbeeldvormingsmethoden kunnen worden ingedeeld in twee hoofdcategorieën. De ene is seriële immunofluorescentie beeldvorming die afhankelijk is van meerdere rondes van weefselkleuring en beeldvorming, en de andere is beeldvorming van massacytometrie in combinatie met zware metalen gelabelde antilichamen 6,7,8,9,10,11,12.
Hier wordt een alternatieve strategie voor op multiplexantilichamen gebaseerde eiwitbeeldvorming geïntroduceerd. In tegenstelling tot de gangbare fluorescentiebeeldvormingsmodaliteit, die slechts 4-5 kanalen tegelijkertijd kan visualiseren vanwege de brede excitatie- en emissiespectra (volledige breedte bij half maximum (FWHM) ~ 500 cm-1), vertoont Raman-microscopie veel smallere spectrale lijnbreedte (FWHM ~ 10 cm-1) en biedt daarom schaalbare multiplexiteit. Onlangs is, door gebruik te maken van het smalle spectrum, een nieuw schema van Raman-microscopie genaamd elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) microscopie ontwikkeld, wat een krachtige strategie biedt voor multiplexed beeldvorming13. Door de elektronisch gekoppelde trillingsmodi van Raman-kleurstoffen te onderzoeken, bereikt epr-SRS een drastisch verbeteringseffect van 1013-voudig op Raman-doorsneden en overwint het gevoeligheidsknelpunt van conventionele Raman-microscopie (Figuur 1A) 13,14,15. Als gevolg hiervan is de detectiegrens van epr-SRS verlegd naar sub-μM, waardoor Raman interessante moleculaire markers zoals specifieke eiwitten en organellen in cellen kan detecteren13,16. Met name met behulp van Raman-kleurstof-geconjugeerde antilichamen werd epr-SRS-beeldvorming van specifieke eiwitten in cellen en weefsels (immuno-eprSRS genoemd) aangetoond met een vergelijkbare gevoeligheid voor standaard immunofluorescentie (figuur 1B)13,17. Door de pompgolflengte met slechts 2 nm af te stemmen, zal het epr-SRS-signaal volledig uitgeschakeld zijn (figuur 1B), wat een hoog trillingscontrast laat zien.
Aan de sondezijde is een reeks regenboogachtige Raman-sondes genaamd Manhattan Raman-verstrooiingskleurstoffen (MARS) ontwikkeld voor antilichaamconjugatie 13,18,19,20. Dit unieke Raman-palet bestaat uit nieuwe kleurstoffen met π-geconjugeerde drievoudige bindingen (aanvullend materiaal), die elk een enkele en smalle epr-SRS-piek in het bioorthogonale Raman-spectraalbereik vertonen (figuur 1C). Door de structuur van de kernchromofoor te wijzigen en beide atomen van de drievoudige binding isotopisch te bewerken (Aanvullend Materiaal), zijn spectraal gescheiden Raman-sondes ontwikkeld. Door gebruik te maken van de schaalbare multiplexiteit, biedt epr-SRS-microscopie in combinatie met het MARS-kleurpalet een optische strategie voor one-shot multiplex-eiwitbeeldvorming in cellen en weefsels.
Immuno-eprSRS biedt een alternatieve strategie voor de huidige multiplex eiwitbeeldvormingsmethoden met unieke sterke punten. Vergeleken met fluorescentiebenaderingen met cyclische kleuring, beeldvorming en signaalverwijdering, zorgt dit op Raman gebaseerde platform voor single-round kleuring en beeldvorming. Daarom omzeilt het praktische complexiteit in cyclische procedures en vereenvoudigt het het protocol grotendeels, waardoor nieuwe gebieden van multiplexed eiwitbeeldvorming worden geopend. Bijvoorbeeld, met behulp van een Raman-dye-op maat gemaakt weefselverwijderingsprotocol, is immuno-eprSRS uitgebreid tot drie dimensies voor sterk gemultiplexte eiwitmapping in dikke intacte weefsels17. Meer dan 10 eiwitdoelen werden gevisualiseerd langs millimeterdikke muizenhersenweefsels17. Meer recent, koppeling van immuno-eprSRS met een geoptimaliseerd biomolecuul-retentie expansie microscopie (ExM) protocol21, one-shot nanoschaal beeldvorming van meerdere doelen is ook aangetoond22. Vergeleken met beeldvorming van massaspectroscopie 4,9 is epr-SRS niet-destructief en heeft het intrinsiek optische sectioning vermogen. Bovendien is epr-SRS tijdefficiënter op weefselscanning. Doorgaans duurt het slechts enkele minuten voordat een weefselgebied van0,25 mm 2 met een pixelgrootte van 0,5 μm een afbeelding heeft voor een enkel epr-SRS-kanaal. De totale beeldtijd van vier SRS-kanalen plus vier fluorescentiekanalen in figuur 4 is bijvoorbeeld ongeveer 10 minuten.
Hier presenteren we het immuno-eprSRS-protocol dat breed toepasbaar is op veel voorkomende weefseltypen, waaronder vers geconserveerde muizenweefsels, FFPE menselijke weefsels en bevroren muizenweefsels. Immuno-eprSRS is gevalideerd voor een panel van epitopen in cellen en weefsels, zoals vermeld in tabel 1. Dit one-shot platform is met name geschikt voor toepassingen waar cyclische strategieën niet goed functioneren. Cyclische fluorescentie is bijvoorbeeld veeleisend voor dikke weefsels, omdat meerdere…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Ruth A. Singer en Richard K.P. Benninger voor het verstrekken van alvleesklierweefsels van muizen. W.M. erkent steun van NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) en US Army (W911NF-19-1-0214).
16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Centrifuge | |||
Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
Paint brush | |||
Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
pH meter | |||
Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Vibratome | Leica | VT1000 | |
Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |