L’imagerie électronique par diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) de colorants Raman de type arc-en-ciel est une nouvelle plate-forme pour l’imagerie de protéines à base d’épitopes hautement multiplexées. Ici, nous présentons un guide pratique comprenant la préparation des anticorps, la coloration des échantillons de tissus, l’assemblage du microscope SRS et l’imagerie tissulaire epr-SRS.
La visualisation d’un vaste éventail de biomarqueurs spécifiques dans les tissus joue un rôle essentiel dans l’exploration des organisations complexes de systèmes biologiques complexes. Par conséquent, les technologies d’imagerie hautement multiplexées ont été de plus en plus appréciées. Nous décrivons ici une plate-forme émergente d’imagerie vibratoire hautement multiplexée de protéines spécifiques avec une sensibilité comparable à l’immunofluorescence standard via l’imagerie électronique par diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) de colorants Raman de type arc-en-ciel. Cette méthode contourne la limite des canaux résolvables spectralement dans l’immunofluorescence conventionnelle et fournit une approche optique unique pour interroger plusieurs marqueurs dans les tissus avec une résolution subcellulaire. Il est généralement compatible avec les préparations tissulaires standard, y compris les tissus fixés au paraformaldéhyde, les tissus congelés et les tissus humains incorporés dans de la paraffine fixée au formol (FFPE). Nous envisageons que cette plate-forme fournira une image plus complète des interactions protéiques des spécimens biologiques, en particulier pour les tissus épais intacts. Ce protocole fournit le flux de travail de la préparation des anticorps à la coloration des échantillons de tissus, à l’assemblage du microscope SRS, à l’imagerie tissulaire epr-SRS.
Les systèmes tissulaires complexes sont composés de sous-populations cellulaires distinctes dont les emplacements spatiaux et les réseaux d’interaction sont profondément liés à leurs fonctions et à leurs dysfonctionnements 1,2. Pour révéler l’architecture tissulaire et interroger sa complexité, la connaissance des emplacements spatiaux des protéines à résolution unicellulaire est essentielle. Par conséquent, les technologies d’imagerie protéique hautement multiplexées ont été de plus en plus appréciées et pourraient devenir une pierre angulaire pour l’étude de la biologie tissulaire 3,4,5. Les méthodes courantes actuelles d’imagerie des protéines multiplexées peuvent être classées en deux catégories principales. L’un est l’imagerie par immunofluorescence en série reposant sur plusieurs cycles de coloration tissulaire et d’imagerie, et l’autre est l’imagerie par cytométrie de masse couplée àdes anticorps marqués par des métaux lourds 6,7,8,9,10,11,12.
Ici, une stratégie alternative pour l’imagerie des protéines multiplexées à base d’anticorps est introduite. Contrairement à la modalité d’imagerie par fluorescence répandue, qui ne peut visualiser que 4 à 5 canaux simultanément en raison des larges spectres d’excitation et d’émission (pleine largeur à la moitié maximale (FWHM) ~ 500 cm-1), la microscopie Raman présente une largeur de ligne spectrale beaucoup plus étroite (FWHM ~ 10 cm-1) et fournit donc une multiplexité évolutive. Récemment, en exploitant le spectre étroit, un nouveau schéma de microscopie Raman nommé microscopie électronique à diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) a été développé, fournissant une stratégie puissante pour l’imagerie multiplexée13. En sondant les modes vibratoires couplés électroniquement des colorants Raman, epr-SRS obtient un effet d’amélioration drastique de10 13 fois sur les sections transversales Raman et surmonte le goulot d’étranglement de sensibilité de la microscopie Raman conventionnelle (Figure 1A)13,14,15. En conséquence, la limite de détection de l’epr-SRS a été repoussée à moins de μM, ce qui permet la détection Raman de marqueurs moléculaires intéressants tels que des protéines et des organites spécifiques à l’intérieur des cellules13,16. En particulier, en utilisant des anticorps conjugués au colorant Raman, l’imagerie epr-SRS de protéines spécifiques dans les cellules et les tissus (appelée immuno-eprSRS) a été démontrée avec une sensibilité comparable à l’immunofluorescence standard (Figure 1B)13,17. En réglant la longueur d’onde de la pompe de seulement 2 nm, le signal epr-SRS sera complètement désactivé (Figure 1B), ce qui présente un contraste vibratoire élevé.
Du côté de la sonde, un ensemble de sondes Raman de type arc-en-ciel appelées colorants de diffusion Raman Manhattan (MARS) a été développé pour la conjugaison des anticorps 13,18,19,20. Cette palette Raman unique se compose de nouveaux colorants portant des liaisons triples conjuguées π (matériau supplémentaire), chacun affichant un pic epr-SRS unique et étroit dans la gamme spectrale Raman bioorthogonale (Figure 1C). En modifiant la structure du chromophore central et en éditant isotopiquement les deux atomes de la triple liaison (matériau supplémentaire), des sondes Raman séparées spectralement ont été développées. Tirant parti de la multiplexité évolutive, la microscopie epr-SRS associée à la palette de colorants MARS offre une stratégie optique pour l’imagerie des protéines multiplex en un seul coup dans les cellules et les tissus.
Immuno-eprSRS fournit une stratégie alternative aux méthodes actuelles d’imagerie des protéines multiplexes avec des forces uniques. Par rapport aux approches de fluorescence avec coloration cyclique, imagerie et élimination du signal, cette plate-forme basée sur Raman assure une coloration et une imagerie à un tour. Par conséquent, il contourne la complexité pratique des procédures cycliques et simplifie largement le protocole, ouvrant ainsi de nouveaux territoires d’imagerie des protéines multiplexées. Par exemple, en exploitant un protocole de nettoyage des tissus adapté aux colorants Raman, l’immuno-eprSRS a été étendue à trois dimensions pour la cartographie des protéines hautement multiplexées dans les tissus intacts épais17. Plus de 10 cibles protéiques ont été visualisées le long de tissus cérébraux de souris d’une épaisseur millimétrique17. Plus récemment, le couplage de l’immuno-eprSRS avec un protocole optimisé de microscopie à expansion de rétention de biomolécules (ExM)21, l’imagerie nanométrique à un coup de plusieurs cibles a également été démontré22. Comparé à la spectroscopie de masse d’imagerie 4,9, epr-SRS est non destructif et a une capacité de sectionnement intrinsèquement optique. De plus, epr-SRS est plus rapide sur le balayage des tissus. En règle générale, une région tissulaire de 0,25 mm2 avec une taille de pixel de 0,5 μm ne prend que quelques minutes à imager pour un seul canal epr-SRS. Par exemple, le temps total d’imagerie de quatre canaux SRS plus quatre canaux de fluorescence dans la figure 4 est d’environ 10 min.
Ici, nous présentons le protocole immuno-eprSRS qui est largement applicable aux types de tissus courants, y compris les tissus de souris fraîchement conservés, les tissus humains FFPE et les tissus de souris congelés. Immuno-eprSRS a été validé pour un panel d’épitopes dans les cellules et les tissus, comme indiqué dans le tableau 1. Cette plate-forme one-shot est particulièrement adaptée aux applications où les stratégies cycliques ne fonctionnent pas bien. Par exemple, la fluorescence c…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Ruth A. Singer et Richard K.P. Benninger d’avoir fourni des tissus pancréatiques de souris. W.M. reconnaît le soutien des NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) et de l’armée américaine (W911NF-19-1-0214).
16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Centrifuge | |||
Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
Paint brush | |||
Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
pH meter | |||
Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Vibratome | Leica | VT1000 | |
Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |