Imagerie tissulaire hautement multiplexée avec des colorants Raman

Summary

L’imagerie électronique par diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) de colorants Raman de type arc-en-ciel est une nouvelle plate-forme pour l’imagerie de protéines à base d’épitopes hautement multiplexées. Ici, nous présentons un guide pratique comprenant la préparation des anticorps, la coloration des échantillons de tissus, l’assemblage du microscope SRS et l’imagerie tissulaire epr-SRS.

Abstract

La visualisation d’un vaste éventail de biomarqueurs spécifiques dans les tissus joue un rôle essentiel dans l’exploration des organisations complexes de systèmes biologiques complexes. Par conséquent, les technologies d’imagerie hautement multiplexées ont été de plus en plus appréciées. Nous décrivons ici une plate-forme émergente d’imagerie vibratoire hautement multiplexée de protéines spécifiques avec une sensibilité comparable à l’immunofluorescence standard via l’imagerie électronique par diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) de colorants Raman de type arc-en-ciel. Cette méthode contourne la limite des canaux résolvables spectralement dans l’immunofluorescence conventionnelle et fournit une approche optique unique pour interroger plusieurs marqueurs dans les tissus avec une résolution subcellulaire. Il est généralement compatible avec les préparations tissulaires standard, y compris les tissus fixés au paraformaldéhyde, les tissus congelés et les tissus humains incorporés dans de la paraffine fixée au formol (FFPE). Nous envisageons que cette plate-forme fournira une image plus complète des interactions protéiques des spécimens biologiques, en particulier pour les tissus épais intacts. Ce protocole fournit le flux de travail de la préparation des anticorps à la coloration des échantillons de tissus, à l’assemblage du microscope SRS, à l’imagerie tissulaire epr-SRS.

Introduction

Les systèmes tissulaires complexes sont composés de sous-populations cellulaires distinctes dont les emplacements spatiaux et les réseaux d’interaction sont profondément liés à leurs fonctions et à leurs dysfonctionnements ^1,2. Pour révéler l’architecture tissulaire et interroger sa complexité, la connaissance des emplacements spatiaux des protéines à résolution unicellulaire est essentielle. Par conséquent, les technologies d’imagerie protéique hautement multiplexées ont été de plus en plus appréciées et pourraient devenir une pierre angulaire pour l’étude de la biologie tissulaire ^3,4,5. Les méthodes courantes actuelles d’imagerie des protéines multiplexées peuvent être classées en deux catégories principales. L’un est l’imagerie par immunofluorescence en série reposant sur plusieurs cycles de coloration tissulaire et d’imagerie, et l’autre est l’imagerie par cytométrie de masse couplée à^des anticorps marqués par des métaux lourds ^{6,7,8,9,10,11,12}.

Ici, une stratégie alternative pour l’imagerie des protéines multiplexées à base d’anticorps est introduite. Contrairement à la modalité d’imagerie par fluorescence répandue, qui ne peut visualiser que 4 à 5 canaux simultanément en raison des larges spectres d’excitation et d’émission (pleine largeur à la moitié maximale (FWHM) ~ 500 ^cm-1), la microscopie Raman présente une largeur de ligne spectrale beaucoup plus étroite (FWHM ~ 10 ^cm-1) et fournit donc une multiplexité évolutive. Récemment, en exploitant le spectre étroit, un nouveau schéma de microscopie Raman nommé microscopie électronique à diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) a été développé, fournissant une stratégie puissante pour l’imagerie multiplexée¹³. En sondant les modes vibratoires couplés électroniquement des colorants Raman, epr-SRS obtient un effet d’amélioration drastique de^{10 13} fois sur les sections transversales Raman et surmonte le goulot d’étranglement de sensibilité de la microscopie Raman conventionnelle (Figure 1A)13,14,15. En conséquence, la limite de détection de l’epr-SRS a été repoussée à moins de μM, ce qui permet la détection Raman de marqueurs moléculaires intéressants tels que des protéines et des organites spécifiques à l’intérieur des cellules^13,16. En particulier, en utilisant des anticorps conjugués au colorant Raman, l’imagerie epr-SRS de protéines spécifiques dans les cellules et les tissus (appelée immuno-eprSRS) a été démontrée avec une sensibilité comparable à l’immunofluorescence standard (Figure 1B)^13,17. En réglant la longueur d’onde de la pompe de seulement 2 nm, le signal epr-SRS sera complètement désactivé (Figure 1B), ce qui présente un contraste vibratoire élevé.

Du côté de la sonde, un ensemble de sondes Raman de type arc-en-ciel appelées colorants de diffusion Raman Manhattan (MARS) a été développé pour la conjugaison des anticorps 13,18,19,20. Cette palette Raman unique se compose de nouveaux colorants portant des liaisons triples conjuguées π (matériau supplémentaire), chacun affichant un pic epr-SRS unique et étroit dans la gamme spectrale Raman bioorthogonale (Figure 1C). En modifiant la structure du chromophore central et en éditant isotopiquement les deux atomes de la triple liaison (matériau supplémentaire), des sondes Raman séparées spectralement ont été développées. Tirant parti de la multiplexité évolutive, la microscopie epr-SRS associée à la palette de colorants MARS offre une stratégie optique pour l’imagerie des protéines multiplex en un seul coup dans les cellules et les tissus.

Immuno-eprSRS fournit une stratégie alternative aux méthodes actuelles d’imagerie des protéines multiplexes avec des forces uniques. Par rapport aux approches de fluorescence avec coloration cyclique, imagerie et élimination du signal, cette plate-forme basée sur Raman assure une coloration et une imagerie à un tour. Par conséquent, il contourne la complexité pratique des procédures cycliques et simplifie largement le protocole, ouvrant ainsi de nouveaux territoires d’imagerie des protéines multiplexées. Par exemple, en exploitant un protocole de nettoyage des tissus adapté aux colorants Raman, l’immuno-eprSRS a été étendue à trois dimensions pour la cartographie des protéines hautement multiplexées dans les tissus intacts épais¹⁷. Plus de 10 cibles protéiques ont été visualisées le long de tissus cérébraux de souris d’une épaisseur millimétrique¹⁷. Plus récemment, le couplage de l’immuno-eprSRS avec un protocole optimisé de microscopie à expansion de rétention de biomolécules (ExM)²¹, l’imagerie nanométrique à un coup de plusieurs cibles a également été démontré²². Comparé à la spectroscopie de masse d’imagerie ^4,9, epr-SRS est non destructif et a une capacité de sectionnement intrinsèquement optique. De plus, epr-SRS est plus rapide sur le balayage des tissus. En règle générale, une région tissulaire de 0,25 mm² avec une taille de pixel de 0,5 μm ne prend que quelques minutes à imager pour un seul canal epr-SRS. Par exemple, le temps total d’imagerie de quatre canaux SRS plus quatre canaux de fluorescence dans la figure 4 est d’environ 10 min.

Protocol

Le protocole a été mené conformément au protocole expérimental animal (AC-AABD1552) approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Columbia. 1. Préparation d’anticorps conjugués Raman-dye Préparer le tampon de conjugaison comme ~0,1 M NaHCO3 dans un tampon PBS, pH = 8,3, conserver à 4 °C. Préparer la solution de sonde MARS fonctionnant sous forme d’ester (matériau supplé…

Representative Results

La figure 3 montre des exemples d’images d’epr-SRS dans différents échantillons, y compris des cellules fixes (figure 3A), des tissus de souris fixés au paraformaldéhyde (PFA) (figure 3B) et des échantillons humains incorporés à de la paraffine fixée au formol (FFPE) (figure 3C). La résolution spatiale de la microscopie SRS est limitée par diffraction, la résolution latérale typique est …

Discussion

Ici, nous présentons le protocole immuno-eprSRS qui est largement applicable aux types de tissus courants, y compris les tissus de souris fraîchement conservés, les tissus humains FFPE et les tissus de souris congelés. Immuno-eprSRS a été validé pour un panel d’épitopes dans les cellules et les tissus, comme indiqué dans le tableau 1. Cette plate-forme one-shot est particulièrement adaptée aux applications où les stratégies cycliques ne fonctionnent pas bien. Par exemple, la fluorescence c…

Materials

16% Paraformaldehyde, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
α-tubulin	Abcam	ab18251	Primary antibodies
α-tubulin	BioLegend	625902	Primary antibodies
β-III-tubulin	BioLegend	657402	Primary antibodies
β-III-tubulin	Abcam	ab41489	Primary antibodies
β-tubulin	Abcam	ab131205	Primary antibodies
Agarose, low gellling temperature	Sigma Aldrich	A9414	For brain embedding
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin)	Abcam	ab52866	Primary antibodies
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin)	Abcam	ab82812	Primary antibodies
Anti-GABA B receptor R2  antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2)	Millipore Sigma	AB2255	Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Primary antibodies
Anti-Glucagon  antibody produced in mouse (Glucagon)	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin)	DAKO	IR00261-2	Primary antibodies
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP)	Abcam	ab7349	Primary antibodies
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Primary antibodies
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP)	Sigma Aldrich	SAB2500747	Primary antibodies
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1)	Milipore	06-1379	Primary antibodies
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin)	Abcam	ab30788	Primary antibodies
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin)	Abcam	ab24525	Primary antibodies
Band-pass filter	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator	Mini Circuits	STRM-50
BNC cable	Thorlabs	2249-C	Coaxial Cable, BNC Male / Male
Broadband dielectric mirror	Thorlabs	BB1-E03	750 – 1100 nm
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Centrifuge
Condenser	Olympus		oil immersion, 1.4 N.A.
Cytokeratin 18	Abcam	ab7797	Primary antibodies
Cytokeratin 18	Abcam	ab24561	Primary antibodies
DC power supply	TopWard	6302D	Bias voltage is 64 V
Dichroic mount	Thorlabs	KM100CL	Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed
Donkey anti-Chicken IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Sheep IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EpCAM	Abcam	ab71916	Primary antibodies
Ethanol	Sigma Aldrich	443611
Fast-speed look-in amplifier	Zurich Instruments	HF2LI	DC – 50 MHz
FFPE Kidney Sample	USBiomax	HuFPT072
Fibrillarin	Abcam	ab5821	Primary antibodies
Giantin	Abcam	ab24586	Primary antibodies
Glucagon	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
H2B	Abcam	ab1790	Primary antibodies
HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
High O.D. bandpass filter	Chroma Technology	ET890/220m	Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
Hydrophobic pen	Fisher Scientific	NC1384846
Insulin	ThermoFisher	701265	Primary antibodies
Integrated SRS laser system	Applied Physics & Electronics, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted laser-scanning microscope	Olympus	FV1200MPE
Kinematic mirror mount	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Low-Profile Hex Adjusters
Lectin from Triticum vulgaris (wheat)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Long-pass dichroic beam splitter	Semrock	Di02-R980-25×36	980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MAP2	BioLegend	801810	Primary antibodies
Microscopy imaging software	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader.
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc 4-Well Dishes	Fisher Scientific	12-566-300
Objective lens	Olympus	XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm
Paint brush
Periscope assembly	Thorlabs	RS99	includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
pH meter
Plate reader	Tecan	Infinite 200 PRO	An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm.
ProLong Gold antifade reagent	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Primary antibodies
Sephadex G-25 Medium	GE Life Sciences	17-0033-01	gel filtration resin for desalting and buffer exchange
Shielded box with BNC connectors	Pomona Electronics	2902	Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female
Si photodiode	Thorlabs	FDS1010	350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area
Synapsin 2	ThermoFisher	OSS00073G	Primary antibodies
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides	Fisher Scientific	22-035813	Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratome	Leica	VT1000
Vimentin	Abcam	ab8069	Primary antibodies
Xylenes	Sigma Aldrich	214736