Высокомультиплексная визуализация тканей с помощью рамановых красителей
Summary
Электронная предрезонансная стимуляция рамановского рассеяния (epr-SRS) радужных рамановских красителей является новой платформой для высокомаплексированной эпитопной визуализации белков. Здесь мы представляем практическое руководство, включающее подготовку антител, окрашивание образцов тканей, сборку микроскопа SRS и визуализацию тканей epr-SRS.
Abstract
Визуализация обширного спектра специфических биомаркеров в тканях играет жизненно важную роль в изучении сложных организаций сложных биологических систем. Следовательно, технологии визуализации с высокой степенью мультиплексирования получают все большую оценку. Здесь мы описываем новую платформу высокомультиплексированной вибрационной визуализации специфических белков с сопоставимой чувствительностью со стандартной иммунофлуоресценцией с помощью электронной предрезонансной стимулированной рамановской рассеяния (epr-SRS) визуализации радужных рамановских красителей. Этот метод обходит предел спектрально-рассасываемых каналов в обычной иммунофлуоресценции и обеспечивает однократный оптический подход для опроса нескольких маркеров в тканях с субклеточным разрешением. Как правило, он совместим со стандартными тканевыми препаратами, включая параформальдегид-фиксированные ткани, замороженные ткани и формалин-фиксированные парафиновые (FFPE) ткани человека. Мы предполагаем, что эта платформа обеспечит более полную картину белковых взаимодействий биологических образцов, особенно для толстых интактных тканей. Этот протокол обеспечивает рабочий процесс от подготовки антител до окрашивания образца ткани, сборки микроскопа SRS и визуализации тканей epr-SRS.
Introduction
Сложные тканевые системы состоят из различных клеточных субпопуляций, пространственные расположения и сети взаимодействия которых глубоко переплетены с их функциями и дисфункциями 1,2. Чтобы выявить архитектуру ткани и исследовать ее сложность, знание пространственных расположений белков при одноклеточном разрешении имеет важное значение. Следовательно, высоко мультиплексированные технологии визуализации белка получают все большую оценку и могут стать краеугольным камнем для изучения биологии тканей 3,4,5. Современные распространенные методы визуализации мультиплексированного белка можно разделить на две основные категории. Одним из них является серийная иммунофлуоресцентная визуализация, основанная на нескольких раундах окрашивания и визуализации тканей, а другая – визуализация массовой цитометрии в сочетании с антителами с метками тяжелых металлов 6,7,8,9,10,11,12.
Здесь представлена альтернативная стратегия визуализации белка на основе мультиплексированных антител. В отличие от распространенной модальности флуоресцентной визуализации, которая может визуализировать только 4-5 каналов одновременно из-за широкого спектра возбуждения и излучения (полная ширина при половинном максимуме (FWHM) ~ 500 см-1), рамановская микроскопия демонстрирует гораздо более узкую спектральную ширину линии (FWHM ~ 10 см-1) и, следовательно, обеспечивает масштабируемую мультиплексию. Недавно, используя узкий спектр, была разработана новая схема рамановской микроскопии, названная электронной предрезонансной стимулированной рамановской микроскопией (epr-SRS), обеспечивающая мощную стратегию для мультиплексированной визуализации13. Исследуя вибрационные режимы с электронной связью рамановских красителей, epr-SRS достигает резкого эффекта усиления в 1013 раз на рамановских поперечных сечениях и преодолевает узкое место чувствительности обычной рамановской микроскопии (рисунок 1A)13,14,15. В результате предел обнаружения epr-SRS был увеличен до суб-мкМ, что позволяет рамановскому обнаружению интересных молекулярных маркеров, таких как специфические белки и органеллы внутри клеток13,16. В частности, с использованием рамановских красителеконъюгированных антител была продемонстрирована эпр-SRS-визуализация специфических белков в клетках и тканях (называемая иммуно-эпр-СРСРС) с сопоставимой чувствительностью со стандартной иммунофлуоресценцией (рисунок 1B)13,17. Настроив длину волны насоса всего на 2 нм, сигнал epr-SRS будет полностью отключен (рисунок 1B), что демонстрирует высокий вибрационный контраст.
На стороне зонда был разработан набор радужных рамановских зондов, называемых красителями Манхэттенского рамановского рассеяния (MARS), для конъюгации антител 13,18,19,20. Эта уникальная рамановская палитра состоит из новых красителей, несущих π-сопряженные тройные связи (дополнительный материал), каждый из которых отображает один и узкий пик epr-SRS в биоортогональном спектральном диапазоне рамановского диапазона (рисунок 1C). Путем модификации структуры основного хромофора и изотопного редактирования обоих атомов тройной связи (дополнительного материала) были разработаны спектрально разделенные рамановские зонды. Используя масштабируемую мультиплексность, микроскопия epr-SRS в сочетании с палитрой красителей MARS предлагает оптическую стратегию для однократной мультиплексной визуализации белка в клетках и тканях.
Immuno-eprSRS обеспечивает альтернативную стратегию современным методам мультиплексной визуализации белка с уникальными сильными сторонами. По сравнению с флуоресцентными подходами с циклическим окрашиванием, визуализацией и удалением сигнала, эта платформа на основе комбинационного рассеяния обеспечивает однокруглое окрашивание и визуализацию. Таким образом, он обходит практическую сложность в циклических процедурах и в значительной степени упрощает протокол, тем самым открывая новые области мультиплексированной белковой визуализации. Например, используя протокол очистки тканей, адаптированный к рамановскому красителю, иммуно-eprSRS был расширен до трех измерений для картирования сильно мультиплексированного белка в толстых интактных тканях17. Более 10 белковых мишеней были визуализированы вдоль миллиметровых тканей мозга мыши17. Совсем недавно было продемонстрировано соединение иммуно-eprSRS с оптимизированной расширительной микроскопией с биомолекулами (ExM) по протоколу21, однокадровая наноразмерная визуализация нескольких мишеней22. По сравнению с визуализационной масс-спектроскопией 4,9, epr-SRS является неразрушающим и обладает внутренне оптической способностью к сечению. Кроме того, epr-SRS более экономит время при сканировании тканей. Как правило, область ткани 0,25мм2 с размером пикселя 0,5 мкм занимает всего несколько минут для изображения одного канала epr-SRS. Например, общее время визуализации четырех каналов SRS плюс четыре флуоресцентных канала на рисунке 4 составляет около 10 мин.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем протокол иммуно-eprSRS, который широко применим к распространенным типам тканей, включая свежесохраненные ткани мыши, ткани человека FFPE и замороженные ткани мыши. Иммуно-eprSRS был валидирован для группы эпитопов в клетках и тканях, как указано в таблице 1. Эта ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Рут А. Сингер и Ричарда К.П. Беннингера за предоставление тканей поджелудочной железы мыши. W.M. признает поддержку со стороны NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) и армии США (W911NF-19-1-0214).
Materials
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
- Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
- Lin, J. -. R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657 (2018).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544, 465 (2017).
- Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
- Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
- Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
- Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
- Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).
- Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).
- Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).
- Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
- Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
- Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537 (2018).
- Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- . Coherent Raman Scattering Microscope Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022)
