La imagen electrónica de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia (epr-SRS) de tintes Raman similares al arco iris es una nueva plataforma para imágenes de proteínas basadas en epítopos altamente multiplexados. Aquí, presentamos una guía práctica que incluye preparación de anticuerpos, tinción de muestras de tejido, ensamblaje de microscopio SRS e imágenes de tejido epr-SRS.
La visualización de una amplia gama de biomarcadores específicos en los tejidos desempeña un papel vital en la exploración de las intrincadas organizaciones de los sistemas biológicos complejos. Por lo tanto, las tecnologías de imágenes altamente multiplexadas han sido cada vez más apreciadas. Aquí, describimos una plataforma emergente de imágenes vibratorias altamente multiplexadas de proteínas específicas con sensibilidad comparable a la inmunofluorescencia estándar a través de imágenes electrónicas de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia (epr-SRS) de colorantes Raman similares al arco iris. Este método elude el límite de los canales resolubles espectralmente en la inmunofluorescencia convencional y proporciona un enfoque óptico de una sola toma para interrogar múltiples marcadores en tejidos con resolución subcelular. Por lo general, es compatible con preparaciones de tejidos estándar, incluidos los tejidos fijos en paraformaldehído, los tejidos congelados y los tejidos humanos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE). Prevemos que esta plataforma proporcionará una imagen más completa de las interacciones proteicas de especímenes biológicos, particularmente para tejidos gruesos intactos. Este protocolo proporciona el flujo de trabajo desde la preparación de anticuerpos hasta la tinción de muestras de tejido, el ensamblaje del microscopio SRS y las imágenes de tejidos epr-SRS.
Los sistemas tisulares complejos están compuestos por distintas subpoblaciones celulares cuyas ubicaciones espaciales y redes de interacción están profundamente entrelazadas con sus funciones y disfunciones 1,2. Para revelar la arquitectura del tejido e interrogar su complejidad, el conocimiento de las ubicaciones espaciales de las proteínas a resolución de una sola célula es esencial. Por lo tanto, las tecnologías de imágenes de proteínas altamente multiplexadas han sido cada vez más apreciadas y podrían convertirse en una piedra angular para el estudio de la biología de los tejidos 3,4,5. Los métodos actuales comunes de imágenes de proteínas multiplexadas se pueden clasificar en dos categorías principales. Una es la imagen de inmunofluorescencia en serie que se basa en múltiples rondas de tinción e imágenes de tejidos, y la otra es la citometría de masa de imágenes junto con anticuerpos marcados con metales pesados 6,7,8,9,10,11,12.
Aquí, se introduce una estrategia alternativa para la obtención de imágenes de proteínas basadas en anticuerpos multiplexados. A diferencia de la modalidad de imágenes de fluorescencia prevalente, que solo puede visualizar 4-5 canales simultáneamente debido a los amplios espectros de excitación y emisión (ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) ~ 500 cm-1), la microscopía Raman exhibe un ancho de línea espectral mucho más estrecho (FWHM ~ 10 cm-1) y, por lo tanto, proporciona una multiplexidad escalable. Recientemente, aprovechando el espectro estrecho, se ha desarrollado un nuevo esquema de microscopía Raman llamado microscopía de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia electrónica (epr-SRS), que proporciona una poderosa estrategia para imágenes multiplexadas13. Al sondear los modos vibratorios acoplados electrónicamente de los tintes Raman, epr-SRS logra un efecto de mejora drástico de 1013 veces en las secciones transversales Raman y supera el cuello de botella de sensibilidad de la microscopía Raman convencional (Figura 1A)13,14,15. Como resultado, el límite de detección de epr-SRS se ha reducido a sub-μM, lo que permite la detección Raman de marcadores moleculares interesantes, como proteínas específicas y orgánulos dentro de las células13,16. En particular, utilizando anticuerpos conjugados con colorante Raman, se demostraron imágenes epr-SRS de proteínas específicas en células y tejidos (llamadas inmuno-eprSRS) con una sensibilidad comparable a la inmunofluorescencia estándar (Figura 1B)13,17. Al ajustar la longitud de onda de la bomba en solo 2 nm, la señal epr-SRS estará completamente apagada (Figura 1B), lo que muestra un alto contraste vibratorio.
En el lado de la sonda, se ha desarrollado un conjunto de sondas Raman similares al arco iris llamadas colorantes de dispersión Raman de Manhattan (MARS) para la conjugación de anticuerpos 13,18,19,20. Esta paleta Raman única consiste en nuevos tintes que llevan π triples enlaces conjugados (Material Suplementario), cada uno de los cuales muestra un pico epr-SRS único y estrecho en el rango espectral Bioorthogonal Raman (Figura 1C). Modificando la estructura del cromóforo central y editando isotópicamente ambos átomos del triple enlace (Material Suplementario), se han desarrollado sondas Raman separadas espectralmente. Aprovechando la multiplexidad escalable, la microscopía epr-SRS junto con la paleta de tintes MARS ofrece una estrategia óptica para imágenes de proteínas multiplex de una sola toma en células y tejidos.
Immuno-eprSRS proporciona una estrategia alternativa a los métodos actuales de imágenes de proteínas multiplex con fortalezas únicas. En comparación con los enfoques de fluorescencia con tinción cíclica, imágenes y eliminación de señales, esta plataforma basada en Raman garantiza la tinción e imágenes de una sola ronda. Por lo tanto, elude la complejidad práctica en los procedimientos cíclicos y simplifica en gran medida el protocolo, abriendo así nuevos territorios de imágenes de proteínas multiplexadas. Por ejemplo, aprovechando un protocolo de limpieza de tejidos adaptado a tinte Raman, immuno-eprSRS se ha extendido a tres dimensiones para el mapeo de proteínas altamente multiplexadas en tejidos gruesos intactos17. Se visualizaron más de 10 dianas proteicas a lo largo de tejidos cerebrales de ratón de un milímetro de grosor17. Más recientemente, también se ha demostrado el acoplamiento de inmuno-eprSRS con un protocolo optimizado de microscopía de expansión de retención de biomoléculas (ExM)21, imágenes a nanoescala de una sola toma de múltiples objetivos22. En comparación con la espectroscopia de masaspor imágenes 4,9, epr-SRS no es destructiva y tiene una capacidad de seccionamiento intrínsecamente óptica. Además, epr-SRS es más eficiente en el tiempo en la exploración de tejidos. Por lo general, una región tisular de 0,25 mm2 con un tamaño de píxel de 0,5 μm tarda solo unos minutos en obtener una imagen de un solo canal epr-SRS. Por ejemplo, el tiempo total de imagen de cuatro canales SRS más cuatro canales de fluorescencia en la Figura 4 es de aproximadamente 10 min.
Aquí, presentamos el protocolo immuno-eprSRS que es ampliamente aplicable a los tipos de tejidos comunes, incluidos los tejidos de ratón recién conservados, los tejidos humanos FFPE y los tejidos de ratón congelados. Immuno-eprSRS ha sido validado para un panel de epítopos en células y tejidos, como se indica en la Tabla 1. Esta plataforma one-shot es particularmente adecuada para aplicaciones donde las estrategias cíclicas no funcionan bien. Por ejemplo, la fluorescencia cíclica es exigente para…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Ruth A. Singer y Richard K.P. Benninger por proporcionar tejidos de páncreas de ratón. W.M. agradece el apoyo de NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) y del Ejército de los Estados Unidos (W911NF-19-1-0214).
16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Centrifuge | |||
Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
Paint brush | |||
Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
pH meter | |||
Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Vibratome | Leica | VT1000 | |
Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |