Svært multiplekset vevsavbildning med Raman Fargestoffer

Summary

Elektronisk pre-resonans stimulert Raman spredning (epr-SRS) avbildning av regnbue-lignende Raman fargestoffer er en ny plattform for svært multiplekset epitop-basert protein avbildning. Her presenterer vi en praktisk guide, inkludert antistoffpreparat, vevsprøvefarging, SRS mikroskopmontering og epr-SRS vevsavbildning.

Abstract

Visualisering av et stort omfang av spesifikke biomarkører i vev spiller en viktig rolle i å utforske de intrikate organisasjonene av komplekse biologiske systemer. Derfor har svært multipleksede bildeteknologier blitt stadig mer verdsatt. Her beskriver vi en ny plattform med svært multippelxed vibrasjonsavbildning av spesifikke proteiner med sammenlignbar følsomhet for standard immunfluorescens via elektronisk pre-resonans stimulert Raman spredning (epr-SRS) bildebehandling av regnbuelignende Raman fargestoffer. Denne metoden omgår grensen for spektralt løselige kanaler i konvensjonell immunfluorescence og gir en ett-skudds optisk tilnærming for å forhøre flere markører i vev med subcellulær oppløsning. Det er generelt kompatibelt med standard vevspreparater, inkludert paraformaldehydfast vev, frossent vev og formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) humant vev. Vi ser for oss at denne plattformen vil gi et mer omfattende bilde av proteininteraksjoner av biologiske prøver, spesielt for tykt intakt vev. Denne protokollen gir arbeidsflyten fra antistoffpreparat til vevsprøvefarging, til SRS mikroskopmontering, til epr-SRS vevsavbildning.

Introduction

Komplekse vevssystemer består av distinkte cellulære subpopulasjoner hvis romlige steder og interaksjonsnettverk er dypt sammenflettet med deres funksjoner og dysfunksjoner ^1,2. For å avsløre vevsarkitekturen og forhøre kompleksiteten, er kunnskap om de romlige plasseringene av proteiner ved encellet oppløsning viktig. Derfor har svært multipleksede proteinavbildningsteknologier blitt stadig mer verdsatt og kan bli en hjørnestein for å studere vevsbiologi ^3,4,5. Nåværende vanlige multipleksede proteinavbildningsmetoder kan klassifiseres i to hovedkategorier. Den ene er seriell immunfluorescensavbildning som er avhengig av flere runder med vevsfarging og avbildning, og den andre er bildemassecytometri kombinert med tungmetallmerkede antistoffer 6,7,8,9,10,11,12.

Her innføres en alternativ strategi for multiplekset antistoffbasert proteinavbildning. I motsetning til den utbredte fluorescensavbildningsmodaliteten, som bare kan visualisere 4-5 kanaler samtidig på grunn av den brede eksitasjonen og utslippsspektraet (full bredde ved halv maksimum (FWHM) ~ 500 ^cm-1), viser Raman-mikroskopi mye smalere spektral linewidth (FWHM ~ 10 ^cm-1) og gir dermed skalerbar multipleksitet. Nylig, ved å utnytte det smale spekteret, har en ny ordning med Raman-mikroskopi kalt elektronisk pre-resonans stimulert Raman-spredning (epr-SRS) mikroskopi blitt utviklet, noe som gir en kraftig strategi for multiplekset bildebehandling¹³. Ved å undersøke de elektronisk koblede vibrasjonsmodusene til Raman-fargestoffer oppnår epr-SRS en drastisk forbedringseffekt på^{10 13} ganger på Raman-tverrsnitt og overvinner følsomhetsflaskehalsen til konvensjonell Raman-mikroskopi (figur 1A)13,14,15. Som et resultat har deteksjonsgrensen for epr-SRS blitt presset til sub-μM, noe som muliggjør Raman-deteksjon av interessante molekylære markører som spesifikke proteiner og organeller inne i cellene^13,16. Spesielt ved bruk av Raman fargestoffkonjugede antistoffer ble epr-SRS-avbildning av spesifikke proteiner i celler og vev (kalt immuno-eprSRS) demonstrert med sammenlignbar følsomhet for standard immunfluorescens (figur 1B) ^13,17. Ved å justere pumpebølgelengden med bare 2 nm, vil epr-SRS-signalet være helt av (figur 1B), som viser høy vibrasjonskontrast.

På sondesiden er det utviklet et sett med regnbuelignende Raman-sonder kalt Manhattan Raman-spredning (MARS) fargestoffer for antistoffkonjugering ^13,18,19,20. Denne unike Raman-paletten består av nye fargestoffer som bærer π-konjugiserte trippelbindinger (tilleggsmateriale), som hver viser en enkelt og smal epr-SRS-topp i det bioortogonale Raman-spektralområdet (figur 1C). Ved å modifisere strukturen til kjernekromoforen og isotopisk redigere begge atomene av trippelbindingen (supplementært materiale), er det utviklet spektralt separerte Raman-sonder. Ved hjelp av den skalerbare multipleksiteten tilbyr epr-SRS-mikroskopi kombinert med MARS-fargepaletten en optisk strategi for ett-skudds multipleksproteinavbildning i celler og vev.

Immuno-eprSRS gir en alternativ strategi for dagens multipleks proteinavbildningsmetoder med unike styrker. Sammenlignet med fluorescens tilnærminger med syklisk farging, avbildning og signalfjerning, sikrer denne Raman-baserte plattformen en-rund farging og avbildning. Derfor omgår den praktisk kompleksitet i sykliske prosedyrer og forenkler i stor grad protokollen, og åpner dermed nye territorier for multiplekset proteinavbildning. For eksempel, ved å utnytte en Raman-farget-skreddersydd vevsryddingsprotokoll, har immuno-eprSRS blitt utvidet til tre dimensjoner for svært multiplekset proteinkartlegging i tykt intakt vev¹⁷. Over 10 proteinmål ble visualisert langs millimeter tykk musehjernevev¹⁷. Mer nylig, kobling immuno-eprSRS med en optimalisert biomolekyl-oppbevaring ekspansjon mikroskopi (ExM) protokoll²¹, ett-skudd nanoskala bildebehandling av flere mål har også blitt demonstrert²². Sammenlignet med avbildningsmassespektroskopi ^4,9, er epr-SRS ikke-ødeleggende og har iboende optisk seksjoneringsevne. Videre er epr-SRS mer tidseffektiv på vevsskanning. Vanligvis tar et vevsområde på 0,25 mm² med en pikselstørrelse på 0,5 μm bare noen få minutter å bilde for en enkelt epr-SRS-kanal. For eksempel er den totale bildetiden til fire SRS-kanaler pluss fire fluorescenskanaler i figur 4 ca. 10 min.

Protocol

Protokollen ble utført i samsvar med dyreforsøksprotokollen (AC-AABD1552) godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Columbia University. 1. Fremstilling av Raman-farget-konjugede antistoffer Klargjør konjugeringsbufferen som ~0,1 M NaHCO3 i PBS-buffer, pH = 8,3, oppbevar ved 4 °C. Forbered N-hydroksysuccinimid (NHS) esterfunksjonell MARS-sonde (tilleggsmateriale) løsning som 3 mM i vannfri DMSO. Syntese av …

Representative Results

Figur 3 viser eksempelbilder av epr-SRS i forskjellige prøver, inkludert faste celler (figur 3A), paraformaldehyd (PFA)-fast musevev (figur 3B) og formalinfaste parafinin innebygde (FFPE) menneskelige prøver (figur 3C). Den romlige oppløsningen til SRS-mikroskopi er diffraksjonsbegrenset, den typiske laterale oppløsningen er ~ 300 nm, og den aksiale oppløsningen er 1-2 μm ved hjelp av nær-infrar?…

Discussion

Her presenterer vi immuno-eprSRS-protokollen som i stor grad gjelder for vanlige vevstyper, inkludert ferskt bevart musevev, FFPE-humant vev og frossent musevev. Immuno-eprSRS er validert for et panel av epitoper i celler og vev, som oppført i tabell 1. Denne one-shot plattformen er spesielt egnet for applikasjoner der sykliske strategier ikke fungerer bra. For eksempel er syklisk fluorescens krevende for tykt vev, da flere runder med 3D-immunisolering er upraktisk lang¹⁷. Det er…

Materials

16% Paraformaldehyde, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
α-tubulin	Abcam	ab18251	Primary antibodies
α-tubulin	BioLegend	625902	Primary antibodies
β-III-tubulin	BioLegend	657402	Primary antibodies
β-III-tubulin	Abcam	ab41489	Primary antibodies
β-tubulin	Abcam	ab131205	Primary antibodies
Agarose, low gellling temperature	Sigma Aldrich	A9414	For brain embedding
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin)	Abcam	ab52866	Primary antibodies
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin)	Abcam	ab82812	Primary antibodies
Anti-GABA B receptor R2  antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2)	Millipore Sigma	AB2255	Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Primary antibodies
Anti-Glucagon  antibody produced in mouse (Glucagon)	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin)	DAKO	IR00261-2	Primary antibodies
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP)	Abcam	ab7349	Primary antibodies
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Primary antibodies
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP)	Sigma Aldrich	SAB2500747	Primary antibodies
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1)	Milipore	06-1379	Primary antibodies
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin)	Abcam	ab30788	Primary antibodies
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin)	Abcam	ab24525	Primary antibodies
Band-pass filter	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator	Mini Circuits	STRM-50
BNC cable	Thorlabs	2249-C	Coaxial Cable, BNC Male / Male
Broadband dielectric mirror	Thorlabs	BB1-E03	750 – 1100 nm
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Centrifuge
Condenser	Olympus		oil immersion, 1.4 N.A.
Cytokeratin 18	Abcam	ab7797	Primary antibodies
Cytokeratin 18	Abcam	ab24561	Primary antibodies
DC power supply	TopWard	6302D	Bias voltage is 64 V
Dichroic mount	Thorlabs	KM100CL	Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed
Donkey anti-Chicken IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Sheep IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EpCAM	Abcam	ab71916	Primary antibodies
Ethanol	Sigma Aldrich	443611
Fast-speed look-in amplifier	Zurich Instruments	HF2LI	DC – 50 MHz
FFPE Kidney Sample	USBiomax	HuFPT072
Fibrillarin	Abcam	ab5821	Primary antibodies
Giantin	Abcam	ab24586	Primary antibodies
Glucagon	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
H2B	Abcam	ab1790	Primary antibodies
HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
High O.D. bandpass filter	Chroma Technology	ET890/220m	Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
Hydrophobic pen	Fisher Scientific	NC1384846
Insulin	ThermoFisher	701265	Primary antibodies
Integrated SRS laser system	Applied Physics & Electronics, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted laser-scanning microscope	Olympus	FV1200MPE
Kinematic mirror mount	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Low-Profile Hex Adjusters
Lectin from Triticum vulgaris (wheat)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Long-pass dichroic beam splitter	Semrock	Di02-R980-25×36	980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MAP2	BioLegend	801810	Primary antibodies
Microscopy imaging software	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader.
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc 4-Well Dishes	Fisher Scientific	12-566-300
Objective lens	Olympus	XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm
Paint brush
Periscope assembly	Thorlabs	RS99	includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
pH meter
Plate reader	Tecan	Infinite 200 PRO	An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm.
ProLong Gold antifade reagent	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Primary antibodies
Sephadex G-25 Medium	GE Life Sciences	17-0033-01	gel filtration resin for desalting and buffer exchange
Shielded box with BNC connectors	Pomona Electronics	2902	Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female
Si photodiode	Thorlabs	FDS1010	350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area
Synapsin 2	ThermoFisher	OSS00073G	Primary antibodies
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides	Fisher Scientific	22-035813	Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratome	Leica	VT1000
Vimentin	Abcam	ab8069	Primary antibodies
Xylenes	Sigma Aldrich	214736