Aislamiento, expansión y diferenciación de células madre mesenquimales de la almohadilla de grasa infrapatelar de la articulación sofocante de cabra

Summary

Las células madre mesenquimales de la almohadilla de grasa infrapatelar (IFP-MSC) se pueden aislar fácilmente de la almohadilla de grasa infrapatelar de la articulación de la rodilla. Proliferan bien in vitro, forman colonias de UFC-F y se diferencian en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos. En este documento, se proporciona la metodología para el aislamiento, expansión y diferenciación de IFP-MSC de la articulación sofocante de cabra.

Abstract

El IFP, presente en la articulación de la rodilla, sirve como una fuente prometedora de MSC. El IFP es un tejido de fácil acceso, ya que se reseca y descarta rutinariamente durante los procedimientos artroscópicos y las cirugías de reemplazo de rodilla. Además, su eliminación se asocia con una morbilidad mínima en el sitio donante. Estudios recientes han demostrado que los IFP-MSC no pierden su capacidad de proliferación durante la expansión in vitro y tienen un potencial de diferenciación osteogénica independiente de la edad. Las IFP-MSC poseen un potencial de diferenciación condrogénica superior en comparación con las MSC derivadas de la médula ósea (BMSC) y las células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC). Aunque estas células se pueden obtener fácilmente de pacientes ancianos y enfermos, su efectividad es limitada. Por lo tanto, el uso de IFP-MSC de donantes sanos es importante para determinar su eficacia en aplicaciones biomédicas. Como el acceso a un donante humano sano es un desafío, los modelos animales podrían ser una mejor alternativa para permitir la comprensión fundamental. Los animales grandes como perros, caballos, ovejas y cabras juegan un papel crucial en la investigación traslacional. Entre estos, la cabra podría ser un modelo preferido ya que la articulación sofocante de la cabra tiene la anatomía más cercana a la articulación de la rodilla humana. Además, el IFP de cabra puede cumplir con los números más altos de MSC necesarios para aplicaciones de regeneración de tejidos. Además, el bajo costo, la disponibilidad y el cumplimiento de los principios de las 3R para la investigación con animales los convierten en un modelo atractivo. Este estudio demuestra un protocolo simple para aislar IFP-MSC de la articulación sofocante de cabras y condiciones de cultivo in vitro para su expansión y diferenciación. El IFP asépticamente aislado de la cabra fue lavado, picado y digerido enzimáticamente. Después de la filtración y centrifugación, las células recolectadas fueron cultivadas. Estas células eran adherentes, tenían una morfología similar a las MSC y demostraron una notable capacidad clonogénica. Además, se diferenciaron en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos, lo que demuestra su multipotencia. En conclusión, el estudio demuestra el aislamiento y la expansión de las MSC, que muestran potencial en aplicaciones de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.

Introduction

Las células madre mesenquimales (CMM) son un candidato atractivo para las terapias basadas en células en medicina regenerativa ^1,2. Se pueden recolectar de una variedad de fuentes de tejidos como médula ósea, cordón umbilical, placenta, pulpa dental y tejido adiposo subcutáneo³. Sin embargo, como la disponibilidad de células madre en adultos es limitada y su procedimiento de aislamiento es a menudo invasivo (lo que resulta en morbilidad en el sitio donante), es deseable tener una fuente alternativa de células madre que pueda eludir estos desafíos.

La articulación de la rodilla es un depósito de varios tipos de células, como las MSC derivadas de almohadillas de grasa infrapatelar, las MSC derivadas de la membrana sinovial, las MSC derivadas del líquido sinovial, los fibroblastos de ligamentos, los condrocitos articulares, etc. ^4,5,6. Estas células tienen el potencial de ser ampliamente exploradas en la investigación basada en la ingeniería de tejidos musculoesqueléticos. Por lo tanto, la articulación de la rodilla podría ser una fuente posible y confiable de múltiples tipos de MSC. El depósito adiposo ubicado en la articulación de la rodilla, conocido como almohadilla de grasa infrapatelar (IFP) o almohadilla de grasa de Hoffa, es una opción prometedora y alternativa de depósito de MSC. El IFP es una fuente de MSC de acceso relativamente fácil y clínicamente obtenible, ya que se reseca y descarta rutinariamente como desechos quirúrgicos durante la artroscopia de rodilla o la cirugía abierta de rodilla. La eliminación del IFP se asocia con una morbilidad mínima en el sitio donante, lo que también lo convierte en una fuente de tejido atractiva. A pesar de tener un perfil fenotípico similar, las MSC de IFP (IFP-MSCs) tienen un mayor potencial clonogénico en comparación con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (BM-MSCs)⁶ y una mejor capacidad proliferativa en comparación con las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (ADSC)⁷. Curiosamente, en comparación con las MSC derivadas del líquido sinovial (SF-MSC), las IFP-MSC no pierden su capacidad proliferativa en los pasajes tardíos, ni el tiempo de duplicación aumenta en los pasajes tardíos. Esto sugiere que, durante la expansión celular, las IFP-MSC pueden lograr un número suficientemente grande de células para aplicaciones de ingeniería de tejidos in vitro sin comprometer su tasa de proliferación⁸. Estudios recientes también han sugerido que las IFP-MSCs poseen un potencial de diferenciación condrogénica superior en comparación con las MSCs derivadas de médula ósea (BMSC) y las MSCs derivadas de tejido adiposo (ADSC), probablemente debido a su proximidad anatómica al cartílago articular, indicando su idoneidad para la ingeniería tisular del cartílago 6,7,9,10. Además, también poseen un potencial de diferenciación osteogénica independiente de la edad¹¹. Se ha demostrado que la inyección intraarticular de IFP-MSCs reduce el dolor y mejora las funciones articulares de la rodilla en pacientes con osteoartritis (OA)^12,13. Además, también se han descrito fuertes respuestas inmunosupresoras y mejores propiedades inmunomoduladoras de IFP-MSCs en presencia de citoquinas inflamatorias durante condiciones patológicas⁶.

Los IFP-MSC son una fuente prometedora y alternativa de MSC; Sin embargo, su beneficio terapéutico en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa es relativamente menos explorado. Los estudios existentes sobre IFP-MSC han utilizado principalmente células de donantes humanos. Entre estos, algunos estudios recientes han investigado IFP-MSC de donantes humanos sanos (pacientes no artríticos, de 17 a 60 años)^6,14, mientras que la mayoría de los estudios han utilizado IFP-MSC de pacientes de edad avanzada sometidos a cirugía de reemplazo total de rodilla (pacientes enfermos, de 70 a 80 años). Como se sabe que tanto la edad como la enfermedad alteran el funcionamiento normal de las células madre (número reducido y pérdida de potencial funcional), esto podría conducir a inconsistencias en el resultado de los estudios basados en MSC 7,15,16,17. Además de eso, el uso de IFP-MSC de pacientes con condiciones fisiopatológicas (por ejemplo, artritis y obesidad) también plantea dificultades para comprender las características básicas de las células sanas in vitro, actuando así como un factor limitante en el desarrollo de terapias basadas en MSC. Para superar estos problemas, el uso de IFP-MSC de donantes sanos es vital. Como el acceso a un donante humano sano es un desafío, los modelos animales podrían ser una mejor alternativa. En este sentido, hay algunos estudios en los que se ha aislado IFP de ratones¹⁸. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de la almohadilla de grasa en ratones normales, los tejidos grasos de múltiples animales se han combinado para obtener suficiente tejido para ejecutar procedimientos experimentales elaborados¹⁹. Por lo tanto, existe la necesidad de un modelo animal grande, que podría cumplir con el requisito de mayor número de células y simultáneamente cumplir con los principios de las 3R (refinar, reemplazar y reducir) en la investigación con animales²⁰. El uso de animales grandes tiene implicaciones significativas en la investigación traslacional. Específicamente, en la ingeniería de tejidos musculoesqueléticos, se ha investigado una variedad de animales grandes como perros, cerdos, ovejas, cabras y caballos²¹. La cabra (Capra aegagrus hircus) es una excelente opción de animal grande ya que su articulación sofocante tiene la anatomía más cercana a la articulación de la rodilla humana^22,23,24. La estructura trabecular del hueso subcondral y el grosor del hueso subcondral de las cabras son similares a los humanos, y la proporción del cartílago al hueso también se informa que es cercana a la de los humanos²¹. Además, las cabras han sido ampliamente domesticadas en todo el mundo, haciéndolas fácilmente disponibles cuando están esqueléticamente maduras. Además, los bajos costos de mantenimiento y el fácil manejo los han convertido en un modelo animal atractivo para la investigación²².

En el presente estudio, se demuestra un protocolo simple para el aislamiento de IFP-MSCs de la articulación sofocante de Capra aegagrus hircus (cabra) y condiciones de cultivo in vitro para su expansión y diferenciación. Las células aisladas son adherentes, tienen morfología similar a MSC, forman colonias de CFU-F (unidad formadora de colonias-fibroblastos) y poseen potencial de diferenciación adipogénica, condrogénica y osteogénica. Por lo tanto, los IFP-MSC muestran potencial como una fuente alternativa de MSC para aplicaciones biomédicas.

Protocol

El protocolo se basa en el aislamiento de IFP-MSCs de cabras. Se recogieron IFP de cabra y sangre de un matadero local. Dado que tales colecciones de tejidos están fuera del ámbito de un Comité Institucional de Ética Animal, no se requería aprobación ética. 1. Aislamiento de IFP-MSCs de la articulación femorotibial de la rodilla de cabra Recolectar la articulación femorotibial de cabra (muestra) que abarca ~ 15 cm cada una de las regiones femoral y tibial de…

Representative Results

Aislamiento de IFP-MSCs de la articulación femorotibial de cabraLos pasos involucrados en el aislamiento de IFP-MSC de la articulación sofocante de una cabra se representan en la Figura 1. La almohadilla de grasa presente en la superficie interna no articulada de la rótula se eliminó, se picó y se digirió enzimáticamente. Los IFP-MSCs fueron aislados con éxito y cultivados in vitro (Figura 2A). <s…

Discussion

En el presente protocolo, se ha proporcionado un método simple, confiable y reproducible para el aislamiento de MSC de IFP de cabra. Las células aisladas utilizando este método se han utilizado con éxito en nuestros estudios previos para la regeneración de tejidos in vitro. Se observó que las células aisladas eran proliferativas, respondían a diversos factores de crecimiento y conservaban su actividad biológica cuando se sembraban en fibras electrohiladas y andamios^25,26</su…

Materials

β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15-mL centrifuge tube	Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	50 µg/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL centrifuge tube	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	For calcium deposition
Amphotericin B	HiMedia	A011	2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate	Sigma	B5655-5TAB	For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA	HiMedia	MB-083	Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer	HiMedia	TCP-182	70 µm
Centrifuge	REMI
Ciprofloxacin	RANBAXY LAB. Limited	B17407T1	2.5 µg/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 µM
DMEM LG	SIGMA	D5523	Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%	Merck	61780805001730
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 µM
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	10 µg/mL
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Magnesium chloride	Merck	61751605001730	For lysis buffer
Methanol	Meck	1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)	Thermoscientific
MUSE Cell analyser	Merck Millipore		For cell counting
OCT compound	Tissue-Tek	4583	Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye	S D Fine-Chem Limited	54304	For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	C3434	3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels			For isolation of IFP-MSC
Sucrose	Merck	1.94953.0521	35 % (w/v)
TGF-β1	Sino Biologicals		Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	For lysis buffer
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	For lysis buffer
Type II collagenase	Gibco	17101015	1.5 mg/mL
Vitamin D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)	NEST