Isolatie, uitbreiding en differentiatie van mesenchymale stamcellen uit de infrapatellaire vetpad van de geitenstikkingsverbinding

Summary

Infrapatellaire vetkussen mesenchymale stamcellen (IFP-MSC’s) kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit de infrapatellaire vetschijf van het kniegewricht. Ze vermenigvuldigen zich goed in vitro, vormen CFU-F-kolonies en differentiëren in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen. Hierin wordt de methodologie gegeven voor de isolatie, uitbreiding en differentiatie van IFP-MSC’s van geitenstikselgewricht.

Abstract

De IFP, aanwezig in het kniegewricht, dient als een veelbelovende bron van MSC’s. De IFP is een gemakkelijk toegankelijk weefsel omdat het routinematig wordt gereseceerd en weggegooid tijdens artroscopische procedures en knievervangende operaties. Bovendien wordt de verwijdering ervan geassocieerd met minimale morbiditeit op de donorplaats. Recente studies hebben aangetoond dat IFP-MSC’s hun proliferatiecapaciteit niet verliezen tijdens in vitro expansie en een leeftijdsonafhankelijk osteogene differentiatiepotentieel hebben. IFP-MSC’s bezitten een superieur chondrogene differentiatiepotentieel in vergelijking met van beenmerg afgeleide MSC’s (BMSCs) en van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC’s). Hoewel deze cellen gemakkelijk te verkrijgen zijn bij oudere en zieke patiënten, is hun effectiviteit beperkt. Daarom is het gebruik van IFP-MSC’s van gezonde donoren belangrijk om hun werkzaamheid in biomedische toepassingen te bepalen. Omdat de toegang tot een gezonde menselijke donor een uitdaging is, kunnen diermodellen een beter alternatief zijn om fundamenteel begrip mogelijk te maken. Grote dieren zoals honden, paarden, schapen en geiten spelen een cruciale rol in translationeel onderzoek. Onder deze zou de geit een voorkeursmodel kunnen zijn, omdat het verstikkingsgewricht van de geit de dichtstbijzijnde anatomie heeft bij het menselijke kniegewricht. Bovendien kan goat-IFP voldoen aan de hogere MSC-aantallen die nodig zijn voor weefselregeneratietoepassingen. Bovendien maken lage kosten, beschikbaarheid en naleving van de 3R-principes voor dieronderzoek ze een aantrekkelijk model. Deze studie toont een eenvoudig protocol voor het isoleren van IFP-MSC’s van het verstikkingsgewricht van geiten en in vitro kweekomstandigheden voor hun expansie en differentiatie. De aseptisch geïsoleerde IFP van de geit werd gewassen, gehakt en enzymatisch verteerd. Na filtratie en centrifugatie werden de verzamelde cellen gekweekt. Deze cellen waren adherent, hadden MSC-achtige morfologie en vertoonden een opmerkelijk clonogene capaciteit. Verder onderscheidden ze in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen, wat hun multipotentie aantoonde. Concluderend toont de studie de isolatie en uitbreiding van MSC’s, die potentieel tonen in weefseltechnologie en regeneratieve geneeskundetoepassingen.

Introduction

Mesenchymale stamcellen (MSC’s) zijn een aantrekkelijke kandidaat voor celgebaseerde therapieën in de regeneratieve geneeskunde ^1,2. Ze kunnen worden geoogst uit verschillende weefselbronnen zoals beenmerg, navelstreng, placenta, tandpulp en onderhuids vetweefsel³. Aangezien de beschikbaarheid van stamcellen bij volwassenen echter beperkt is en hun isolatieprocedure vaak invasief is (wat resulteert in morbiditeit op de donorplaats), is het wenselijk om een alternatieve stamcelbron te hebben die deze uitdagingen kan omzeilen.

Het kniegewricht is een depot van verschillende celtypen, zoals infrapatellaire vetkussen-afgeleide MSC’s, synoviale membraan-afgeleide MSC’s, synoviale vloeistof-afgeleide MSC’s, ligament fibroblasten, gewrichts chondrocyten, enz^{. 4,5,6}. Deze cellen hebben het potentieel om op grote schaal te worden onderzocht in musculoskeletale weefseltechnologie-gebaseerd onderzoek. Daarom zou het kniegewricht een mogelijke en betrouwbare bron kunnen zijn van meerdere soorten MSC’s. Vetdepot in het kniegewricht, bekend als de infrapatellar fat pad (IFP) of Hoffa’s fat pad, is een veelbelovende en alternatieve keuze van MSC depot. De IFP is een relatief gemakkelijk toegankelijke en klinisch haalbare bron van MSC’s, omdat het routinematig wordt gereseceerd en weggegooid als chirurgisch afval tijdens knieartroscopie of open kniechirurgie. Verwijdering van de IFP wordt geassocieerd met minimale morbiditeit op de donorplaats, waardoor het ook een aantrekkelijke weefselbron is. Hoewel ze een vergelijkbaar fenotypisch profiel hebben, hebben MSC’s van IFP (IFP-MSC’s) een verbeterd clonogene potentieel in vergelijking met van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (BM-MSC’s)⁶ en een betere proliferatieve capaciteit in vergelijking met subcutane adipose-afgeleide stamcellen (ADSC’s)⁷. Interessant is dat in vergelijking met synoviale vloeistof-afgeleide MSC’s (SF-MSC’s), IFP-MSC’s hun proliferatieve capaciteit niet verliezen bij late passages, noch neemt de verdubbelingstijd toe bij late passages. Dit suggereert dat IFP-MSC’s tijdens celexpansie een voldoende groot aantal cellen kunnen bereiken voor in vitro weefselmanipulatietoepassingen zonder hun proliferatiesnelheid in gevaar te brengen⁸. Recente studies hebben ook gesuggereerd dat IFP-MSC’s een superieur chondrogene differentiatiepotentieel bezitten in vergelijking met van beenmerg afgeleide MSC’s (BMSCs) en van vetweefsel afgeleide MSC’s (ADSC’s), waarschijnlijk vanwege hun anatomische nabijheid tot gewrichtskraakbeen, wat wijst op hun geschiktheid voor kraakbeenweefseltechnologie 6,7,9,10. Bovendien bezitten ze ook leeftijdsonafhankelijk osteogene differentiatiepotentiaal¹¹. Intra-articulaire injectie van IFP-MSC’s heeft aangetoond dat het pijn vermindert en de functies van het kniegewricht verbetert bij patiënten met artrose (OA)^12,13. Verder zijn sterke immunosuppressieve reacties en verbeterde immunomodulerende eigenschappen van IFP-MSC’s in aanwezigheid van inflammatoire cytokines tijdens pathologische aandoeningen ook gemeld⁶.

IFP-MSC’s zijn een veelbelovende en alternatieve bron van MSC’s; hun therapeutische voordeel in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde wordt echter relatief minder onderzocht. De bestaande studies over IFP-MSC’s hebben voornamelijk gebruik gemaakt van cellen van menselijke donoren. Onder deze, een paar recente studies hebben IFP-MSC’s van gezonde menselijke donoren (niet-artritis patiënten, leeftijd 17-60 jaar)^6,14 onderzocht, terwijl de meeste studies IFP-MSC’s hebben gebruikt van oudere patiënten die een totale knievervangende operatie ondergaan (zieke patiënten, leeftijd 70-80 jaar). Aangezien bekend is dat zowel leeftijd als ziekte de normale werking van stamcellen veranderen (verminderd aantal en verlies van functioneel potentieel), kan dit mogelijk leiden tot inconsistenties in de uitkomst van de op MSC gebaseerde studies 7,15,16,17. Daarnaast vormt het gebruik van IFP-MSC’s van patiënten met pathofysiologische aandoeningen (bijv. artritis en obesitas) ook problemen om de basiskenmerken van gezonde cellen in vitro te begrijpen, waardoor het een beperkende factor is bij de ontwikkeling van op MSC’s gebaseerde therapieën. Om deze problemen op te lossen, is het gebruik van IFP-MSC’s van gezonde donoren van vitaal belang. Omdat de toegang tot een gezonde menselijke donor een uitdaging is, kunnen diermodellen een beter alternatief zijn. In dit opzicht zijn er een paar studies waarbij IFP is geïsoleerd uit muizen¹⁸. Vanwege de kleine omvang van het vetkussen bij normale muizen, zijn vetweefsels van meerdere dieren echter gecombineerd om voldoende weefsel te krijgen om uitgebreide experimentele procedures uit te voeren¹⁹. Daarom is er behoefte aan een groot diermodel, dat zou kunnen voldoen aan de eis voor het hogere aantal cellen en tegelijkertijd zou kunnen voldoen aan de 3R-principes (verfijnen, vervangen en verminderen) in dieronderzoek²⁰. Het gebruik van grote dieren heeft belangrijke implicaties in translationeel onderzoek. Specifiek, in musculoskeletale weefseltechnologie, is een reeks grote dieren zoals honden, varkens, schapen, geiten en paarden onderzocht²¹. Geit (Capra aegagrus hircus) is een uitstekende keuze van grote dieren omdat het verstikkingsgewricht de dichtstbijzijnde anatomie heeft bij het menselijke kniegewricht 22,23,24. De subchondrale bottrabeculaire structuur en subchondrale botdikte van geiten zijn vergelijkbaar met mensen, en het aandeel van het kraakbeen tot bot is ook gemeld dat het dicht bij de mens^{ligt 21}. Bovendien zijn geiten over de hele wereld op grote schaal gedomesticeerd, waardoor ze gemakkelijk beschikbaar zijn als ze skeletachtig volwassen zijn. Verder hebben lage onderhoudskosten en eenvoudige bediening ze tot een aantrekkelijk diermodel voor onderzoek gemaakt²².

In deze studie wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van IFP-MSC’s uit het verstikkingsgewricht van Capra aegagrus hircus (geit) en in vitro kweekomstandigheden voor hun expansie en differentiatie aangetoond. De geïsoleerde cellen zijn adherent, hebben MSC-achtige morfologie, vormen CFU-F (kolonievormende eenheid-fibroblast) kolonies en bezitten adipogene, chondrogene en osteogene differentiatiepotentialen. Daarom tonen IFP-MSC’s potentieel als een alternatieve bron van MSC’s voor biomedische toepassingen.

Protocol

Het protocol is gebaseerd op de isolatie van IFP-MSC’s van geiten. Geiten-IFP en bloed werden verzameld in een lokaal slachthuis. Aangezien dergelijke weefselcollecties buiten het bereik van een institutionele commissie voor dierethiek vallen, was ethische goedkeuring niet vereist. 1. Isolatie van IFP-MSC’s uit het femorotibiale gewricht van geitenknie Verzamel het femorotibiale gewricht (monster) van de geit dat ~ 15 cm elk van de femur- en tibiale gebieden van de a…

Representative Results

Isolatie van IFP-MSC’s uit het femorotibiale gewricht van de geitDe stappen die betrokken zijn bij de isolatie van IFP-MSC’s van het verstikkingsgewricht van een geit zijn weergegeven in figuur 1. Het vetkussen dat aanwezig was in het binnenste niet-articulerende oppervlak van de patella werd verwijderd, gehakt en enzymatisch verteerd. De IFP-MSC’s werden met succes geïsoleerd en in vitro gekweekt (figuur 2A). <p class="jove_co…

Discussion

In dit protocol is een eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode voor de isolatie van MSC’s van geiten-IFP opgenomen. Cellen geïsoleerd met behulp van deze methode zijn met succes gebruikt in onze eerdere studies voor in vitro weefselregeneratie. Er werd waargenomen dat de geïsoleerde cellen proliferatief waren, reageerden op verschillende groeifactoren en hun biologische activiteit behielden wanneer ze werden gezaaid op elektrospunvezels en steigers^25,26<sup class="…

Materials

β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15-mL centrifuge tube	Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	50 µg/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL centrifuge tube	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	For calcium deposition
Amphotericin B	HiMedia	A011	2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate	Sigma	B5655-5TAB	For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA	HiMedia	MB-083	Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer	HiMedia	TCP-182	70 µm
Centrifuge	REMI
Ciprofloxacin	RANBAXY LAB. Limited	B17407T1	2.5 µg/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 µM
DMEM LG	SIGMA	D5523	Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%	Merck	61780805001730
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 µM
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	10 µg/mL
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Magnesium chloride	Merck	61751605001730	For lysis buffer
Methanol	Meck	1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)	Thermoscientific
MUSE Cell analyser	Merck Millipore		For cell counting
OCT compound	Tissue-Tek	4583	Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye	S D Fine-Chem Limited	54304	For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	C3434	3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels			For isolation of IFP-MSC
Sucrose	Merck	1.94953.0521	35 % (w/v)
TGF-β1	Sino Biologicals		Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	For lysis buffer
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	For lysis buffer
Type II collagenase	Gibco	17101015	1.5 mg/mL
Vitamin D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)	NEST