Isolement, expansion et différenciation des cellules souches mésenchymateuses du coussinet adipeux infra-patellaire de l’articulation étouffante de chèvre

Summary

Les cellules souches mésenchymateuses du coussinet adipeux infrapatellaire (IFP-MSC) peuvent être isolées facilement du coussinet adipeux infrapatellaire de l’articulation du genou. Ils prolifèrent bien in vitro, forment des colonies CFU-F et se différencient en lignées adipogènes, chondrogènes et ostéogéniques. La méthodologie d’isolement, d’expansion et de différenciation des IFP-MSC par rapport à l’articulation d’étouffement de chèvre est fournie.

Abstract

L’IFP, présent dans l’articulation du genou, est une source prometteuse de CSM. L’IFP est un tissu facilement accessible car il est régulièrement réséqué et jeté lors de procédures arthroscopiques et de chirurgies de remplacement du genou. De plus, son élimination est associée à une morbidité minimale du site donneur. Des études récentes ont démontré que les IFP-MSC ne perdent pas leur capacité de prolifération lors de l’expansion in vitro et ont un potentiel de différenciation ostéogénique indépendant de l’âge. Les IFP-MSC possèdent un potentiel de différenciation chondrogénique supérieur à celui des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMSC) et des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC). Bien que ces cellules soient facilement accessibles chez les patients âgés et malades, leur efficacité est limitée. Par conséquent, l’utilisation d’IFP-MSC provenant de donneurs sains est importante pour déterminer leur efficacité dans des applications biomédicales. Comme l’accès à un donneur humain en bonne santé est difficile, les modèles animaux pourraient être une meilleure alternative pour permettre une compréhension fondamentale. Les grands animaux tels que les chiens, les chevaux, les moutons et les chèvres jouent un rôle crucial dans la recherche translationnelle. Parmi ceux-ci, la chèvre pourrait être un modèle préféré puisque l’articulation étouffante de la chèvre a l’anatomie la plus proche de l’articulation du genou humain. De plus, l’IFP caprin peut atteindre les valeurs MSC plus élevées nécessaires pour les applications de régénération tissulaire. De plus, le faible coût, la disponibilité et le respect des principes 3R pour la recherche animale en font un modèle attrayant. Cette étude démontre un protocole simple pour isoler les IFP-MSC de l’articulation étouffante des chèvres et les conditions de culture in vitro pour leur expansion et leur différenciation. L’IFP isolé de manière aseptique de la chèvre a été lavé, haché et digéré par voie enzymatique. Après filtration et centrifugation, les cellules collectées ont été cultivées. Ces cellules étaient adhérentes, avaient une morphologie semblable à celle des CSM et présentaient une capacité clonogène remarquable. En outre, ils se sont différenciés en lignées adipogènes, chondrogènes et ostéogéniques, démontrant leur multipotence. En conclusion, l’étude démontre l’isolement et l’expansion des CSM, qui présentent un potentiel dans les applications d’ingénierie tissulaire et de médecine régénérative.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont un candidat intéressant pour les thérapies cellulaires en médecine régénérative ^1,2. Ils peuvent être récoltés à partir d’une variété de sources tissulaires telles que la moelle osseuse, le cordon ombilical, le placenta, la pulpe dentaire et le tissu adipeux sous-cutané³. Cependant, comme la disponibilité des cellules souches chez les adultes est limitée et que leur procédure d’isolement est souvent invasive (entraînant une morbidité au site donneur), il est souhaitable de disposer d’une autre source de cellules souches qui pourrait contourner ces défis.

L’articulation du genou est un dépôt de divers types de cellules, tels que les CSM dérivés du coussinet adipeux infrapatellar, les CSM dérivés de la membrane synoviale, les CSM dérivés du liquide synovial, les fibroblastes ligamentaires, les chondrocytes articulaires, etc. ^4,5,6. Ces cellules ont le potentiel d’être largement explorées dans la recherche basée sur le génie tissulaire musculo-squelettique. Par conséquent, l’articulation du genou pourrait être une source possible et fiable de plusieurs types de CSM. Le dépôt adipeux situé dans l’articulation du genou, connu sous le nom de coussinet adipeux infrapatellaire (IFP) ou coussinet adipeux de Hoffa, est un choix prometteur et alternatif de dépôt MSC. L’IFP est une source relativement facilement accessible et cliniquement accessible de CSM, car il est régulièrement réséqué et jeté sous forme de déchets chirurgicaux lors d’une arthroscopie du genou ou d’une chirurgie ouverte du genou. L’élimination de l’IFP est associée à une morbidité minimale du site donneur, ce qui en fait également une source tissulaire attrayante. Tout en ayant un profil phénotypique similaire, les CSM de l’IFP (IFP-MSC) ont un potentiel clonogène accru par rapport aux cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BM-MSCs)⁶ et une meilleure capacité de prolifération par rapport aux cellules souches sous-cutanées dérivées du tissu adipeux (ADSC)⁷. Il est intéressant de noter que, par rapport aux CSM dérivées du liquide synovial (SF-MSC), les IFP-MSC ne perdent pas leur capacité de prolifération aux passages tardifs, pas plus que le temps de doublement n’augmente aux passages tardifs. Cela suggère que, pendant l’expansion cellulaire, les IFP-MSC peuvent atteindre un nombre suffisamment important de cellules pour des applications d’ingénierie tissulaire in vitro sans compromettre leur taux de prolifération⁸. Des études récentes ont également suggéré que les IFP-MSC possèdent un potentiel de différenciation chondrogénique supérieur à celui des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMSC) et des CSM dérivées du tissu adipeux (ADSC), probablement en raison de leur proximité anatomique avec le cartilage articulaire, ce qui indique leur aptitude à l’ingénierie tissulaire du cartilage 6,7,9,10. De plus, ils possèdent également un potentiel de différenciation ostéogénique indépendant de l’âge¹¹. Il a été démontré que l’injection intra-articulaire d’IFP-MSCs réduit la douleur et améliore les fonctions articulaires du genou chez les patients atteints d’arthrose12,13. En outre, de fortes réponses immunosuppressives et une amélioration des propriétés immunomodulatrices des IFP-MSC en présence de cytokines inflammatoires dans des conditions pathologiques ont également été rapportées⁶.

Les IFP-MSC sont une source alternative prometteuse de MSC; Cependant, leur bénéfice thérapeutique en génie tissulaire et en médecine régénérative est relativement moins exploré. Les études existantes sur les IFP-MSC ont principalement utilisé des cellules provenant de donneurs humains. Parmi celles-ci, quelques études récentes ont examiné les IFP-MSC de donneurs humains sains (patients non arthritiques, âgés de 17 à 60 ans)^6,14, tandis que la plupart des études ont utilisé des IFP-MSC de patients âgés subissant une arthroplastie totale du genou (patients malades, âgés de 70 à 80 ans). Comme on sait que l’âge et la maladie altèrent le fonctionnement normal des cellules souches (réduction du nombre et perte de potentiel fonctionnel), cela pourrait potentiellement entraîner des incohérences dans les résultats des études basées sur les CSM 7,15,16,17. En outre, l’utilisation d’IFP-MSC provenant de patients atteints de maladies physiopathologiques (par exemple, arthrite et obésité) pose également des difficultés pour comprendre les caractéristiques de base des cellules saines in vitro, agissant ainsi comme un facteur limitant dans le développement de thérapies basées sur les CSM. Pour surmonter ces problèmes, l’utilisation de l’IFP-MSC provenant de donneurs sains est vitale. Comme l’accès à un donneur humain en bonne santé est difficile, les modèles animaux pourraient être une meilleure alternative. À cet égard, il existe quelques études où l’IFP a été isolé chez des souris¹⁸. Cependant, en raison de la petite taille du coussinet graisseux chez les souris normales, les tissus adipeux de plusieurs animaux ont été combinés pour obtenir suffisamment de tissu pour exécuter des procédures expérimentales élaborées¹⁹. Par conséquent, il est nécessaire de disposer d’un grand modèle animal, qui pourrait répondre à l’exigence d’un plus grand nombre de cellules tout en respectant les principes 3R (affiner, remplacer et réduire) dans la recherche animale²⁰. L’utilisation de grands animaux a des implications importantes dans la recherche translationnelle. Plus précisément, dans le domaine de l’ingénierie tissulaire musculo-squelettique, une gamme de grands animaux tels que les chiens, les porcs, les moutons, les chèvres et les chevaux ont été étudiés²¹. La chèvre (Capra aegagrus hircus) est un excellent choix de gros animal car son articulation étouffante a l’anatomie la plus proche de l’articulation du genou humain^22,23,24. La structure trabéculaire osseuse sous-chondrale et l’épaisseur osseuse sous-chondrale des chèvres sont similaires à celles des humains, et la proportion du cartilage par rapport à l’os serait également proche de celle des humains²¹. En outre, les chèvres ont été largement domestiquées dans le monde entier, ce qui les rend facilement disponibles lorsqu’elles sont squelettiques. En outre, les faibles coûts d’entretien et la facilité de manipulation en ont fait un modèle animal attrayant pour la recherche²².

Dans la présente étude, un protocole simple pour l’isolement des IFP-MSC de l’articulation étouffante de Capra aegagrus hircus (chèvre) et des conditions de culture in vitro pour leur expansion et leur différenciation sont démontrés. Les cellules isolées sont adhérentes, ont une morphologie semblable à celle des CSM, forment des colonies de fibroblastes CFU-F (fibroblastes formant des colonies) et possèdent un potentiel de différenciation adipogénique, chondrogénique et ostéogénique. Par conséquent, les IFP-MSC présentent un potentiel en tant que source alternative de MSC pour les applications biomédicales.

Protocol

Le protocole est basé sur l’isolement des IFP-MSC des chèvres. L’IFP caprin et le sang ont été prélevés dans un abattoir local. Étant donné que ces collections de tissus ne relèvent pas d’un comité d’éthique des animaux institutionnel, l’approbation éthique n’était pas requise. 1. Isolement des IFP-CSM de l’articulation fémorotibiale du genou de chèvre Prélever l’articulation fémorotibiale de chèvre (échantillon) englobant ~15 cm ch…

Representative Results

Isolement des IFP-MSC de l’articulation fémorotibiale de chèvreLes étapes de l’isolement des IFP-MSC de l’articulation étouffante d’une chèvre sont illustrées à la figure 1. Le coussinet graisseux présent dans la surface interne non articulée de la rotule a été retiré, haché et digéré enzymatiquement. Les IFP-MSC ont été isolés avec succès et cultivés in vitro (Figure 2A). <str…

Discussion

Dans le protocole actuel, une méthode simple, fiable et reproductible pour l’isolement des CSM de l’IFP caprin a été fournie. Les cellules isolées à l’aide de cette méthode ont été utilisées avec succès dans nos études précédentes pour la régénération tissulaire in vitro. Il a été observé que les cellules isolées étaient prolifératives, répondaient à divers facteurs de croissance et conservaient leur activité biologique lorsqu’elles étaient ensemencées sur des fibres électrofi…

Materials

β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15-mL centrifuge tube	Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	50 µg/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL centrifuge tube	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	For calcium deposition
Amphotericin B	HiMedia	A011	2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate	Sigma	B5655-5TAB	For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA	HiMedia	MB-083	Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer	HiMedia	TCP-182	70 µm
Centrifuge	REMI
Ciprofloxacin	RANBAXY LAB. Limited	B17407T1	2.5 µg/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 µM
DMEM LG	SIGMA	D5523	Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%	Merck	61780805001730
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 µM
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	10 µg/mL
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Magnesium chloride	Merck	61751605001730	For lysis buffer
Methanol	Meck	1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)	Thermoscientific
MUSE Cell analyser	Merck Millipore		For cell counting
OCT compound	Tissue-Tek	4583	Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye	S D Fine-Chem Limited	54304	For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	C3434	3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels			For isolation of IFP-MSC
Sucrose	Merck	1.94953.0521	35 % (w/v)
TGF-β1	Sino Biologicals		Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	For lysis buffer
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	For lysis buffer
Type II collagenase	Gibco	17101015	1.5 mg/mL
Vitamin D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)	NEST