Infrapatellar fettpute mesenkymale stamceller (IFP-MSCs) kan enkelt isoleres fra kneleddets infrapatellar fettpute. De sprer seg godt in vitro, danner CFU-F-kolonier og skiller seg ut i adipogene, kondrogene og osteogene linjer. Her er metodikken for isolering, utvidelse og differensiering av IFP-MSCs fra geitkvelerfeste gitt.
IFP, som finnes i kneleddet, fungerer som en lovende kilde til MSCs. IFP er et lett tilgjengelig vev som det rutinemessig resekteres og kastes under artroskopiske prosedyrer og kneproteseoperasjoner. I tillegg er fjerningen forbundet med minimal morbiditet på donorstedet. Nylige studier har vist at IFP-MSCs ikke mister sin proliferasjonskapasitet under in vitro-ekspansjon og har aldersuavhengig osteogen differensieringspotensial. IFP-MSCs har overlegent kondrogent differensieringspotensial sammenlignet med benmargsavledede MSCs (BMSCs) og fettavledede stamceller (ADSC). Selv om disse cellene er lett oppnåelige fra eldre og syke pasienter, er deres effektivitet begrenset. Derfor er bruk av IFP-MSCs fra friske givere viktig for å bestemme effekten i biomedisinske applikasjoner. Ettersom tilgang til en sunn menneskelig donor er utfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ for å muliggjøre grunnleggende forståelse. Store dyr som hunder, hester, sauer og geiter spiller en avgjørende rolle i translasjonsforskning. Blant disse kan geiten være en foretrukket modell siden geitens kvelerledd har den nærmeste anatomien til det menneskelige kneleddet. Videre kan geit-IFP oppfylle de høyere MSC-tallene som trengs for vevregenereringsapplikasjoner. Videre gjør lave kostnader, tilgjengelighet og overholdelse av 3R-prinsippene for dyreforsøk dem til en attraktiv modell. Denne studien demonstrerer en enkel protokoll for å isolere IFP-MSCs fra kvelningsleddet til geiter og in vitro-kulturforhold for utvidelse og differensiering. Den aseptisk isolerte IFP fra geiten ble vasket, hakket og fordøyd enzymatisk. Etter filtrering og sentrifugering ble de oppsamlede cellene dyrket. Disse cellene var vedvarende, hadde MSCs-lignende morfologi og demonstrerte bemerkelsesverdig klonogen evne. Videre differensierte de seg i adipogene, kondrogene og osteogene linjer, og demonstrerte deres multipotens. Avslutningsvis demonstrerer studien isolering og utvidelse av MSCs, som viser potensial i vevsteknikk og regenerative medisinapplikasjoner.
Mesenkymale stamceller (MSCs) er en attraktiv kandidat for cellebaserte terapier i regenerativ medisin 1,2. De kan høstes fra en rekke vevskilder som benmarg, navlestreng, morkake, tannmasse og subkutant fettvev3. Men da tilgjengeligheten av stamceller hos voksne er begrenset og deres isolasjonsprosedyre ofte er invasiv (noe som resulterer i morbiditet på donorstedet), er det ønskelig å ha en alternativ stamcellekilde som kan omgå disse utfordringene.
Kneleddet er et depot av forskjellige celletyper, for eksempel infrapatellar fettpute-avledede MSCer, synovialmembran-avledede MSCer, synovialvæskeavledede MSCer, ligamentfibroblaster, leddkondrocytter, etc 4,5,6. Disse cellene har potensial til å bli mye utforsket i muskuloskeletale vev engineering-basert forskning. Derfor kan kneleddet være en mulig og pålitelig kilde til flere typer MSCs. Fettdepot som ligger i kneleddet, kjent som infrapatellar fettpute (IFP) eller Hoffas fettpute, er et lovende og alternativt valg av MSC depot. IFP er en relativt lett tilgjengelig og klinisk oppnåelig kilde til MSCs, da den rutinemessig resekteres og kastes som kirurgisk avfall under knelektroskopi eller åpen knekirurgi. Fjerning av IFP er forbundet med minimal donor-site morbiditet, noe som også gjør det til en attraktiv vevskilde. Selv om de har en lignende fenotypisk profil, har MSCer fra IFP (IFP-MSCs) forbedret klonogent potensial sammenlignet med benmargsavledede mesenkymale stamceller (BM-MSCs)6 og bedre proliferativ kapasitet sammenlignet med subkutane fettavledede stamceller (ADSC)7. Interessant nok, sammenlignet med synovialvæskeavledede MSCer (SF-MSCs), mister IFP-MSCs ikke sin proliferative kapasitet ved sene passasjer, og doblingstiden øker heller ikke ved sene passasjer. Dette antyder at IFP-MSC-er under celleutvidelse kan oppnå et tilstrekkelig stort antall celler for in vitro vevstekniske applikasjoner uten at det går ut over spredningshastigheten8. Nylige studier har også antydet at IFP-MSCs har overlegen kondrogen differensieringspotensial sammenlignet med benmargsavledede MSCs (BMSCs) og fettavledede MSCs (ADSCs), sannsynligvis på grunn av deres anatomiske nærhet til leddbrusk, noe som indikerer deres egnethet for bruskvevsteknikk 6,7,9,10. Videre har de også aldersuavhengig osteogen differensieringspotensial11. Intraartikulær injeksjon av IFP-MSCs har vist seg å redusere smerte og forbedre kneleddfunksjoner hos pasienter med slitasjegikt (OA) 12,13. Videre erdet også rapportert sterke immunsuppressive responser og forbedrede immunmodulerende egenskaper til IFP-MSCs i nærvær av inflammatoriske cytokiner under patologiske forhold 6.
IFP-MSCs er en lovende og alternativ kilde til MSCs; Imidlertid er deres terapeutiske fordel i vevsteknikk og regenerativ medisin relativt mindre utforsket. De eksisterende studiene på IFP-MSCs har i stor grad benyttet celler fra humane givere. Blant disse har noen få nyere studier undersøkt IFP-MSCs fra friske humane donorer (ikke-artrittiske pasienter, i alderen 17-60 år) 6,14, mens de fleste studiene har brukt IFP-MSCs fra eldre pasienter som gjennomgår total kneprotesekirurgi (syke pasienter, alder 70-80 år). Siden både alder og sykdom er kjent for å endre stamcellers normale funksjon (redusert antall og tap av funksjonelt potensial), kan dette potensielt føre til uoverensstemmelser i utfallet av de MSC-baserte studiene 7,15,16,17. I tillegg til dette utgjør bruken av IFP-MSCs fra pasienter med patofysiologiske tilstander (f.eks. leddgikt og fedme) også vanskeligheter med å forstå de grunnleggende egenskapene til friske celler in vitro, og fungerer dermed som en begrensende faktor i utviklingen av MSCs-baserte terapier. For å overvinne disse problemene er bruk av IFP-MSCs fra friske givere avgjørende. Ettersom tilgangen til en sunn menneskelig donor er utfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ. I denne forbindelse er det noen få studier der IFP har blitt isolert fra mus18. På grunn av den lille størrelsen på fettputen i normale mus, har fettvev fra flere dyr blitt kombinert for å få nok vev til å utføre forseggjorte eksperimentelle prosedyrer19. Derfor er det behov for en stor dyremodell, som kan oppfylle kravet til det høyere antall celler og samtidig overholde 3R-prinsippene (forfine, erstatte og redusere) i dyreforsøk20. Bruken av store dyr har betydelige implikasjoner i translasjonsforskning. Spesielt i muskel- og skjelettvevsteknikk har en rekke store dyr som hunder, griser, sauer, geiter og hester blitt undersøkt21. Geit (Capra aegagrus hircus) er et utmerket valg av stort dyr siden kvelerleddet har den nærmeste anatomien til det menneskelige kneleddet22,23,24. Den subchondrale beintrabekulære strukturen og subchondral beintykkelse av geiter ligner på mennesker, og andelen av brusk til bein er også rapportert å være nær mennesker21. I tillegg har geiter blitt mye tammet over hele verden, noe som gjør dem lett tilgjengelige når de er skjelettmodne. Videre har lave vedlikeholdskostnader og enkel håndtering gjort dem til en attraktiv dyremodell for forskning22.
I denne studien er det vist en enkel protokoll for isolering av IFP-MSCs fra kvelerleddet til Capra aegagrus hircus (geit) og in vitro-kulturbetingelser for utvidelse og differensiering. De isolerte cellene er vedheftige, har MSC-lignende morfologi, danner CFU-F (kolonidannende enhetsfibroblast) kolonier, og har adipogent, kondrogent og osteogent differensieringspotensial. Derfor viser IFP-MSCs potensial som en alternativ kilde til MSCs for biomedisinske applikasjoner.
I denne protokollen er det gitt en enkel, pålitelig og reproduserbar metode for isolering av MSCs fra geit IFP. Celler isolert ved hjelp av denne metoden har blitt brukt med hell i våre tidligere studier for in vitro vevregenerering. Det ble observert at de isolerte cellene var proliferative, reagerte på ulike vekstfaktorer, og beholdt sin biologiske aktivitet når de ble sådd på elektrospunfibre og stillaser25,26. Videre ble det observert at et sto…
The authors have nothing to disclose.
SH anerkjenner støtte fra instituttets postdoktorstipend av IIT Kanpur og SYST-stipend fra DST (SEED Division) (SP / YO / 618/2018). AM anerkjenner Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) for et instituttstipend. DSK anerkjenner Gireesh Jankinath Chair Professorship og Institutt for bioteknologi, India, for finansiering (BT / PR22445 / MED / 32/571/2016). AM, SH og DSK takker Mehta Family Centre for Engineering in Medicine ved IIT-Kanpur for deres sjenerøse støtte.
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
15-mL centrifuge tube | Corning | ||
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
50-mL centrifuge tube | Corning | ||
Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
Biological safety cabinet | |||
BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
Centrifuge | REMI | ||
Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
Ethanol | Merck | 100983 | |
FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |