Isolering, utvidelse og differensiering av mesenkymale stamceller fra Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Summary

Infrapatellar fettpute mesenkymale stamceller (IFP-MSCs) kan enkelt isoleres fra kneleddets infrapatellar fettpute. De sprer seg godt in vitro, danner CFU-F-kolonier og skiller seg ut i adipogene, kondrogene og osteogene linjer. Her er metodikken for isolering, utvidelse og differensiering av IFP-MSCs fra geitkvelerfeste gitt.

Abstract

IFP, som finnes i kneleddet, fungerer som en lovende kilde til MSCs. IFP er et lett tilgjengelig vev som det rutinemessig resekteres og kastes under artroskopiske prosedyrer og kneproteseoperasjoner. I tillegg er fjerningen forbundet med minimal morbiditet på donorstedet. Nylige studier har vist at IFP-MSCs ikke mister sin proliferasjonskapasitet under in vitro-ekspansjon og har aldersuavhengig osteogen differensieringspotensial. IFP-MSCs har overlegent kondrogent differensieringspotensial sammenlignet med benmargsavledede MSCs (BMSCs) og fettavledede stamceller (ADSC). Selv om disse cellene er lett oppnåelige fra eldre og syke pasienter, er deres effektivitet begrenset. Derfor er bruk av IFP-MSCs fra friske givere viktig for å bestemme effekten i biomedisinske applikasjoner. Ettersom tilgang til en sunn menneskelig donor er utfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ for å muliggjøre grunnleggende forståelse. Store dyr som hunder, hester, sauer og geiter spiller en avgjørende rolle i translasjonsforskning. Blant disse kan geiten være en foretrukket modell siden geitens kvelerledd har den nærmeste anatomien til det menneskelige kneleddet. Videre kan geit-IFP oppfylle de høyere MSC-tallene som trengs for vevregenereringsapplikasjoner. Videre gjør lave kostnader, tilgjengelighet og overholdelse av 3R-prinsippene for dyreforsøk dem til en attraktiv modell. Denne studien demonstrerer en enkel protokoll for å isolere IFP-MSCs fra kvelningsleddet til geiter og in vitro-kulturforhold for utvidelse og differensiering. Den aseptisk isolerte IFP fra geiten ble vasket, hakket og fordøyd enzymatisk. Etter filtrering og sentrifugering ble de oppsamlede cellene dyrket. Disse cellene var vedvarende, hadde MSCs-lignende morfologi og demonstrerte bemerkelsesverdig klonogen evne. Videre differensierte de seg i adipogene, kondrogene og osteogene linjer, og demonstrerte deres multipotens. Avslutningsvis demonstrerer studien isolering og utvidelse av MSCs, som viser potensial i vevsteknikk og regenerative medisinapplikasjoner.

Introduction

Mesenkymale stamceller (MSCs) er en attraktiv kandidat for cellebaserte terapier i regenerativ medisin ^1,2. De kan høstes fra en rekke vevskilder som benmarg, navlestreng, morkake, tannmasse og subkutant fettvev³. Men da tilgjengeligheten av stamceller hos voksne er begrenset og deres isolasjonsprosedyre ofte er invasiv (noe som resulterer i morbiditet på donorstedet), er det ønskelig å ha en alternativ stamcellekilde som kan omgå disse utfordringene.

Kneleddet er et depot av forskjellige celletyper, for eksempel infrapatellar fettpute-avledede MSCer, synovialmembran-avledede MSCer, synovialvæskeavledede MSCer, ligamentfibroblaster, leddkondrocytter, etc ^4,5,6. Disse cellene har potensial til å bli mye utforsket i muskuloskeletale vev engineering-basert forskning. Derfor kan kneleddet være en mulig og pålitelig kilde til flere typer MSCs. Fettdepot som ligger i kneleddet, kjent som infrapatellar fettpute (IFP) eller Hoffas fettpute, er et lovende og alternativt valg av MSC depot. IFP er en relativt lett tilgjengelig og klinisk oppnåelig kilde til MSCs, da den rutinemessig resekteres og kastes som kirurgisk avfall under knelektroskopi eller åpen knekirurgi. Fjerning av IFP er forbundet med minimal donor-site morbiditet, noe som også gjør det til en attraktiv vevskilde. Selv om de har en lignende fenotypisk profil, har MSCer fra IFP (IFP-MSCs) forbedret klonogent potensial sammenlignet med benmargsavledede mesenkymale stamceller (BM-MSCs)⁶ og bedre proliferativ kapasitet sammenlignet med subkutane fettavledede stamceller (ADSC)⁷. Interessant nok, sammenlignet med synovialvæskeavledede MSCer (SF-MSCs), mister IFP-MSCs ikke sin proliferative kapasitet ved sene passasjer, og doblingstiden øker heller ikke ved sene passasjer. Dette antyder at IFP-MSC-er under celleutvidelse kan oppnå et tilstrekkelig stort antall celler for in vitro vevstekniske applikasjoner uten at det går ut over spredningshastigheten⁸. Nylige studier har også antydet at IFP-MSCs har overlegen kondrogen differensieringspotensial sammenlignet med benmargsavledede MSCs (BMSCs) og fettavledede MSCs (ADSCs), sannsynligvis på grunn av deres anatomiske nærhet til leddbrusk, noe som indikerer deres egnethet for bruskvevsteknikk 6,7,9,10. Videre har de også aldersuavhengig osteogen differensieringspotensial¹¹. Intraartikulær injeksjon av IFP-MSCs har vist seg å redusere smerte og forbedre kneleddfunksjoner hos pasienter med slitasjegikt (OA) ^12,13. Videre er^{det også rapportert} sterke immunsuppressive responser og forbedrede immunmodulerende egenskaper til IFP-MSCs i nærvær av inflammatoriske cytokiner under patologiske forhold 6.

IFP-MSCs er en lovende og alternativ kilde til MSCs; Imidlertid er deres terapeutiske fordel i vevsteknikk og regenerativ medisin relativt mindre utforsket. De eksisterende studiene på IFP-MSCs har i stor grad benyttet celler fra humane givere. Blant disse har noen få nyere studier undersøkt IFP-MSCs fra friske humane donorer (ikke-artrittiske pasienter, i alderen 17-60 år) ^6,14, mens de fleste studiene har brukt IFP-MSCs fra eldre pasienter som gjennomgår total kneprotesekirurgi (syke pasienter, alder 70-80 år). Siden både alder og sykdom er kjent for å endre stamcellers normale funksjon (redusert antall og tap av funksjonelt potensial), kan dette potensielt føre til uoverensstemmelser i utfallet av de MSC-baserte studiene 7,15,16,17. I tillegg til dette utgjør bruken av IFP-MSCs fra pasienter med patofysiologiske tilstander (f.eks. leddgikt og fedme) også vanskeligheter med å forstå de grunnleggende egenskapene til friske celler in vitro, og fungerer dermed som en begrensende faktor i utviklingen av MSCs-baserte terapier. For å overvinne disse problemene er bruk av IFP-MSCs fra friske givere avgjørende. Ettersom tilgangen til en sunn menneskelig donor er utfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ. I denne forbindelse er det noen få studier der IFP har blitt isolert fra mus¹⁸. På grunn av den lille størrelsen på fettputen i normale mus, har fettvev fra flere dyr blitt kombinert for å få nok vev til å utføre forseggjorte eksperimentelle prosedyrer¹⁹. Derfor er det behov for en stor dyremodell, som kan oppfylle kravet til det høyere antall celler og samtidig overholde 3R-prinsippene (forfine, erstatte og redusere) i dyreforsøk²⁰. Bruken av store dyr har betydelige implikasjoner i translasjonsforskning. Spesielt i muskel- og skjelettvevsteknikk har en rekke store dyr som hunder, griser, sauer, geiter og hester blitt undersøkt²¹. Geit (Capra aegagrus hircus) er et utmerket valg av stort dyr siden kvelerleddet har den nærmeste anatomien til det menneskelige kneleddet^22,23,24. Den subchondrale beintrabekulære strukturen og subchondral beintykkelse av geiter ligner på mennesker, og andelen av brusk til bein er også rapportert å være nær mennesker²¹. I tillegg har geiter blitt mye tammet over hele verden, noe som gjør dem lett tilgjengelige når de er skjelettmodne. Videre har lave vedlikeholdskostnader og enkel håndtering gjort dem til en attraktiv dyremodell for forskning²².

I denne studien er det vist en enkel protokoll for isolering av IFP-MSCs fra kvelerleddet til Capra aegagrus hircus (geit) og in vitro-kulturbetingelser for utvidelse og differensiering. De isolerte cellene er vedheftige, har MSC-lignende morfologi, danner CFU-F (kolonidannende enhetsfibroblast) kolonier, og har adipogent, kondrogent og osteogent differensieringspotensial. Derfor viser IFP-MSCs potensial som en alternativ kilde til MSCs for biomedisinske applikasjoner.

Protocol

Protokollen er basert på isolering av IFP-MSCs fra geiter. Geit IFP og blod ble samlet inn fra et lokalt slakteri. Siden slike vevssamlinger er utenfor ansvarsområdet til en institusjonell dyreetisk komité, var det ikke nødvendig med etisk godkjenning. 1. Isolering av IFP-MSCs fra femorotibial ledd av geit kne Samle geit femorotibial ledd (prøve) som omfatter ~ 15 cm hver av lårbenet og tibial regioner av bakre lemmer. Plasser prøven umiddelbart i en sterilise…

Representative Results

Isolering av IFP-MSCs fra femorotibial ledd av geitTrinnene som er involvert i isoleringen av IFP-MSCs fra kvelningsleddet til en geit, er avbildet i figur 1. Fettputen som var tilstede i patellens indre, ikke-artikulerende overflate, ble fjernet, hakket og enzymatisk fordøyd. IFP-MSCene ble vellykket isolert og dyrket in vitro (figur 2A). Utvidelse og klonogen evne til IFP-MSCsDe is…

Discussion

I denne protokollen er det gitt en enkel, pålitelig og reproduserbar metode for isolering av MSCs fra geit IFP. Celler isolert ved hjelp av denne metoden har blitt brukt med hell i våre tidligere studier for in vitro vevregenerering. Det ble observert at de isolerte cellene var proliferative, reagerte på ulike vekstfaktorer, og beholdt sin biologiske aktivitet når de ble sådd på elektrospunfibre og stillaser^25,26. Videre ble det observert at et sto…

Materials

β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15-mL centrifuge tube	Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	50 µg/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL centrifuge tube	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	For calcium deposition
Amphotericin B	HiMedia	A011	2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate	Sigma	B5655-5TAB	For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA	HiMedia	MB-083	Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer	HiMedia	TCP-182	70 µm
Centrifuge	REMI
Ciprofloxacin	RANBAXY LAB. Limited	B17407T1	2.5 µg/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 µM
DMEM LG	SIGMA	D5523	Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%	Merck	61780805001730
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 µM
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	10 µg/mL
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Magnesium chloride	Merck	61751605001730	For lysis buffer
Methanol	Meck	1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)	Thermoscientific
MUSE Cell analyser	Merck Millipore		For cell counting
OCT compound	Tissue-Tek	4583	Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye	S D Fine-Chem Limited	54304	For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	C3434	3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels			For isolation of IFP-MSC
Sucrose	Merck	1.94953.0521	35 % (w/v)
TGF-β1	Sino Biologicals		Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	For lysis buffer
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	For lysis buffer
Type II collagenase	Gibco	17101015	1.5 mg/mL
Vitamin D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)	NEST