Isolering, expansion och differentiering av mesenkymala stamceller från den infrapatellära fettkudden i getkvävningsleden

Summary

Infrapatellar fettkudde mesenkymala stamceller (IFP-MSC) kan enkelt isoleras från knäledens infrapatellära fettkudde. De sprider sig väl in vitro, bildar CFU-F-kolonier och differentierar till adilogen, kondrogen och osteogen härstamning. Häri tillhandahålls metoden för isolering, expansion och differentiering av IFP-MSC från getkvävningsled.

Abstract

IFP, som finns i knäleden, fungerar som en lovande källa till MSC. IFP är en lättillgänglig vävnad eftersom den rutinmässigt resekteras och kasseras under artroskopiska procedurer och knäbytesoperationer. Dessutom är dess borttagning förknippad med minimal sjuklighet på givarplatsen. Nya studier har visat att IFP-MSC inte förlorar sin spridningskapacitet under in vitro-expansion och har åldersoberoende osteogen differentieringspotential. IFP-MSC har överlägsen kondrogen differentieringspotential jämfört med benmärgshärledda MSC (BMSC) och fett-härledda stamceller (ADSC). Även om dessa celler lätt kan erhållas från åldrade och sjuka patienter, är deras effektivitet begränsad. Därför är det viktigt att använda IFP-MSC från friska givare för att bestämma deras effektivitet i biomedicinska applikationer. Eftersom tillgången till en frisk mänsklig donator är utmanande kan djurmodeller vara ett bättre alternativ för att möjliggöra grundläggande förståelse. Stora djur som hundar, hästar, får och getter spelar en avgörande roll i translationell forskning. Bland dessa kan geten vara en föredragen modell eftersom getens kvävningsled har den närmaste anatomin till den mänskliga knäleden. Dessutom kan get-IFP uppfylla de högre MSC-nummer som behövs för vävnadsregenereringsapplikationer. Dessutom gör låg kostnad, tillgänglighet och efterlevnad av 3R-principerna för djurförsök dem till en attraktiv modell. Denna studie visar ett enkelt protokoll för att isolera IFP-MSC från kvävningsfogen av getter och in vitro-odlingsförhållanden för deras expansion och differentiering. Den aseptiskt isolerade IFP från geten tvättades, maledes och smältes enzymatiskt. Efter filtrering och centrifugering odlades de uppsamlade cellerna. Dessa celler var vidhäftande, hade MSC-liknande morfologi och visade anmärkningsvärd klonogen förmåga. Vidare differentierade de sig till adipogena, kondrogeniska och osteogena släktlinjer, vilket visade deras multipotens. Sammanfattningsvis visar studien isolering och expansion av MSC, som visar potential inom vävnadsteknik och regenerativ medicin.

Introduction

Mesenkymala stamceller (MSC) är en attraktiv kandidat för cellbaserade terapier inom regenerativ medicin ^1,2. De kan skördas från en mängd olika vävnadskällor såsom benmärg, navelsträng, placenta, tandmassa och subkutan fettvävnad³. Eftersom tillgången på stamceller hos vuxna är begränsad och deras isoleringsförfarande ofta är invasivt (vilket resulterar i sjuklighet på donatorstället) är det önskvärt att ha en alternativ stamcellskälla som kan kringgå dessa utmaningar.

Knäleden är en depå av olika celltyper, såsom infrapatellar fettkudde-härledda MSC, synovialmembran-härledda MSC, synovialvätske-härledda MSC, ligamentfibroblaster, ledade kondrocyter, etc ^4,5,6. Dessa celler har potential att utforskas i stor utsträckning inom muskuloskeletal vävnadsteknikbaserad forskning. Därför kan knäleden vara en möjlig och pålitlig källa till flera typer av MSC: er. Fettdepå i knäleden, känd som infrapatellär fettkudde (IFP) eller Hoffas fettkudde, är ett lovande och alternativt val av MSC-depå. IFP är en relativt lättillgänglig och kliniskt erhållbar källa till MSC, eftersom den rutinmässigt resekteras och kasseras som kirurgiskt avfall under knäartroskopi eller öppen knäkirurgi. Avlägsnande av IFP är förknippat med minimal sjuklighet på donatorplatsen, vilket också gör det till en attraktiv vävnadskälla. Även om MSC från IFP (IFP-MSC) har en liknande fenotypisk profil har de förbättrad klonogen potential jämfört med benmärgshärledda mesenkymala stamceller (BM-MSC)⁶ och bättre proliferativ kapacitet jämfört med subkutana fett-härledda stamceller (ADSC)⁷. Intressant nog, jämfört med synovialvätske-härledda MSC (SF-MSC), förlorar IFP-MSC inte sin proliferativa kapacitet vid sena passager, och fördubblingstiden ökar inte heller vid sena passager. Detta tyder på att IFP-MSC under cellutvidgning kan uppnå ett tillräckligt stort antal celler för in vitro-vävnadstekniska tillämpningar utan att kompromissa med deras spridningshastighet⁸. Nya studier har också föreslagit att IFP-MSC har överlägsen kondrogen differentieringspotential jämfört med benmärgshärledda MSC (BMSC) och fett-härledda MSC (ADSC), troligen på grund av deras anatomiska närhet till ledbrosk, vilket indikerar deras lämplighet för broskvävnadsteknik 6,7,9,10. Dessutom har de också åldersoberoende osteogen differentieringspotential¹¹. Intraartikulär injektion av IFP-MSC har visat sig minska smärta och förbättra knäledsfunktioner hos patienter med artros (OA)^12,13. Vidare har starka immunsuppressiva svar och förbättrade immunmodulerande egenskaper hos IFP-MSC i närvaro av inflammatoriska cytokiner under patologiska tillstånd också rapporterats⁶.

IFP-MSC är en lovande och alternativ källa till MSC; emellertid är deras terapeutiska fördel inom vävnadsteknik och regenerativ medicin relativt mindre utforskad. De befintliga studierna på IFP-MSC har i stor utsträckning använt celler från mänskliga givare. Bland dessa har några nyligen genomförda studier undersökt IFP-MSC från friska mänskliga givare (icke-artritiska patienter, i åldern 17-60 år)^6,14, medan de flesta studierna har använt IFP-MSC från åldrade patienter som genomgår total knäbyteskirurgi (sjuka patienter, ålder 70-80 år). Eftersom både ålder och sjukdom är kända för att förändra stamcellernas normala funktion (minskat antal och förlust av funktionell potential) kan detta potentiellt leda till inkonsekvenser i resultatet av de MSC-baserade studierna 7,15,16,17. Utöver detta utgör användningen av IFP-MSC från patienter med patofysiologiska tillstånd (t.ex. artrit och fetma) också svårigheter att förstå de grundläggande egenskaperna hos friska celler in vitro och fungerar därmed som en begränsande faktor i utvecklingen av MSC-baserade terapier. För att övervinna dessa problem är användningen av IFP-MSC från friska givare avgörande. Eftersom tillgången till en frisk mänsklig donator är utmanande kan djurmodeller vara ett bättre alternativ. I detta avseende finns det några studier där IFP har isolerats från möss¹⁸. På grund av fettkuddens lilla storlek hos normala möss har dock fettvävnader från flera djur kombinerats för att få tillräckligt med vävnad för att utföra detaljerade experimentella procedurer¹⁹. Därför finns det ett behov av en stor djurmodell, som kan uppfylla kravet på det högre antalet celler och samtidigt följa 3R-principerna (förfina, ersätta och minska) i djurförsök²⁰. Användningen av stora djur har betydande konsekvenser i translationell forskning. Specifikt, inom muskuloskeletal vävnadsteknik, har en rad stora djur som hundar, grisar, får, getter och hästar undersökts²¹. Get (Capra aegagrus hircus) är ett utmärkt val av stora djur eftersom dess kvävningsled har den närmaste anatomin till den mänskliga knäleden^22,23,24. Den subkondrala bentrabekulära strukturen och subkondrala bentjockleken hos getter liknar människor, och andelen brosk till ben rapporteras också vara nära människor²¹. Dessutom har getter tämjts i stor utsträckning över hela världen, vilket gör dem lättillgängliga när de är skelettmogna. Vidare har låga underhållskostnader och enkel hantering gjort dem till en attraktiv djurmodell för forskning²².

I denna studie demonstreras ett enkelt protokoll för isolering av IFP-MSC från kvävningsleden av Capra aegagrus hircus (get) och in vitro-odlingsförhållanden för deras expansion och differentiering. De isolerade cellerna är vidhäftande, har MSC-liknande morfologi, bildar CFU-F-kolonier (kolonibildande enhetsfibroblast) och har adilogen, kondrogen och osteogen differentieringspotential. Därför visar IFP-MSC potential som en alternativ källa till MSC för biomedicinska applikationer.

Protocol

Protokollet är baserat på isolering av IFP-MSC från getter. Get IFP och blod samlades in från ett lokalt slakteri. Eftersom sådana vävnadssamlingar ligger utanför en institutionell djurförsöksetisk kommittés ansvarsområde krävdes inget etiskt godkännande. 1. Isolering av IFP-MSC från den femorotibiala leden i getknäet Samla get femorotibial led (prov) som omfattar ~ 15 cm var och en av lårbens- och tibialregionerna i bakbenen. Lägg omedelbart provet …

Representative Results

Isolering av IFP-MSC från getens femorotibiala ledStegen som är involverade i isoleringen av IFP-MSC från kvävningsleden hos en get visas i figur 1. Fettkudden som finns i den inre icke-artikulerande ytan av patella avlägsnades, maledes och smältes enzymatiskt. IFP-MSC:erna isolerades framgångsrikt och odlades in vitro (figur 2A). Expansion och klonogen förmåga hos IFP-MSCDe …

Discussion

I detta protokoll har en enkel, pålitlig och reproducerbar metod för isolering av MSC från get-IFP tillhandahållits. Celler isolerade med denna metod har framgångsrikt använts i våra tidigare studier för vävnadsregenerering in vitro. Det observerades att de isolerade cellerna var proliferativa, reagerade på olika tillväxtfaktorer och behöll sin biologiska aktivitet när de såddes på elektrospunfibrer och byggnadsställningar^25,26. Dessutom …

Materials

β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15-mL centrifuge tube	Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	50 µg/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL centrifuge tube	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	For calcium deposition
Amphotericin B	HiMedia	A011	2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate	Sigma	B5655-5TAB	For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA	HiMedia	MB-083	Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer	HiMedia	TCP-182	70 µm
Centrifuge	REMI
Ciprofloxacin	RANBAXY LAB. Limited	B17407T1	2.5 µg/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 µM
DMEM LG	SIGMA	D5523	Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%	Merck	61780805001730
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 µM
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	10 µg/mL
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Magnesium chloride	Merck	61751605001730	For lysis buffer
Methanol	Meck	1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)	Thermoscientific
MUSE Cell analyser	Merck Millipore		For cell counting
OCT compound	Tissue-Tek	4583	Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye	S D Fine-Chem Limited	54304	For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	C3434	3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels			For isolation of IFP-MSC
Sucrose	Merck	1.94953.0521	35 % (w/v)
TGF-β1	Sino Biologicals		Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	For lysis buffer
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	For lysis buffer
Type II collagenase	Gibco	17101015	1.5 mg/mL
Vitamin D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)	NEST