Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT & RUN-methode en data-analyseworkflow

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63655
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2,4, 3, 1,4, 1,4
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, 4Health Sciences Research Institute, University of California, Merced
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft een experimentele methode en data-analyse workflow voor splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT & RUN) in de menselijke schimmelpathogeen Candida albicans.

Abstract

Regulerende transcriptiefactoren beheersen veel belangrijke biologische processen, waaronder cellulaire differentiatie, reacties op omgevingsverstoringen en -spanningen en gastheer-pathogeeninteracties. Het bepalen van de genoombrede binding van regulerende transcriptiefactoren aan DNA is essentieel om de functie van transcriptiefactoren in deze vaak complexe biologische processen te begrijpen. Splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT & RUN) is een moderne methode voor genoombrede mapping van in vivo eiwit-DNA-bindingsinteracties die een aantrekkelijk alternatief is voor de traditionele en veel gebruikte chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door sequencing (ChIP-seq) -methode. CUT&RUN is geschikt voor een experimentele opstelling met een hogere doorvoer en heeft een aanzienlijk hoger dynamisch bereik met lagere sequencingkosten per monster dan ChIP-seq. Hier worden een uitgebreid CUT&RUN-protocol en bijbehorende data-analyseworkflow beschreven die is toegesneden op genoombrede analyse van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties in de menselijke schimmelpathogeen Candida albicans . Dit gedetailleerde protocol omvat alle noodzakelijke experimentele procedures, van epitoop tagging van transcriptiefactorcoderende genen tot bibliotheekvoorbereiding voor sequencing; daarnaast bevat het een aangepaste computationele workflow voor CUT & RUN-gegevensanalyse.

Introduction

Candida albicans is een klinisch relevante, polymorfe menselijke schimmelpathogeen die bestaat in een verscheidenheid aan verschillende groeiwijzen, zoals de planktonische (vrij zwevende) groeiwijze en als gemeenschappen van strak gehechte cellen beschermd door een extracellulaire matrix, bekend als de biofilmmodus van groei 1,2,3. Net als bij andere ontwikkelings- en cellulaire processen is biofilmontwikkeling een belangrijke C. albicans virulentie eigenschap waarvan bekend is dat deze op transcriptioneel niveau wordt gecontroleerd door regulerende transcriptiefactoren (TF's) die op een sequentiespecifieke manier aan DNA binden4. Onlangs zijn chromatineregulatoren en histonmodifiers ook naar voren gekomen als belangrijke regulatoren van C. albicans biofilmvorming5 en morfogenese6 door dna-toegankelijkheid te bemiddelen. Om de complexe biologie van deze belangrijke schimmelpathogeen te begrijpen, zijn effectieve methoden om de genoombrede lokalisatie van specifieke TF's te bepalen tijdens verschillende ontwikkelings- en cellulaire processen waardevol.

Chromatine immunoprecipitatie gevolgd door sequencing (ChIP-seq) is een veelgebruikte methode om eiwit-DNA interacties in C. albicans 5,6 te onderzoeken en heeft grotendeels de meer klassieke chromatine immunoprecipitatie gevolgd door microarray (ChIP-chip)9 methode vervangen. Zowel ChIP-seq- als ChIP-chipmethoden vereisen echter een groot aantal invoercellen10, wat een complicerende factor kan zijn bij het onderzoeken van TF's in de context van specifieke monsters en groeiwijzen, zoals biofilms verzameld van patiënten of diermodellen van infectie. Bovendien levert de chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) -test vaak een aanzienlijke hoeveelheid achtergrondsignaal op in het hele genoom, wat een hoge mate van verrijking vereist voor het doelwit van belang om signaal voldoende van ruis te scheiden. Hoewel de ChIP-chip-assay tegenwoordig grotendeels verouderd is, maken de sequencingdieptes die nodig zijn voor ChIP-seq deze test onbetaalbaar voor veel onderzoekers, met name degenen die meerdere TF's en / of chromatine-geassocieerde eiwitten bestuderen.

Splitsing onder doelen en loslaten met behulp van nuclease (CUT&RUN) is een aantrekkelijk alternatief voor ChIP-seq. Het werd in 2017 ontwikkeld door het Henikoff-lab om de beperkingen van ChIP-seq en chromatine endogene splitsing te omzeilen, gevolgd door sequencing ChEC-seq 11,12, een andere methode om eiwit-DNA-interacties op genoombreed niveau te identificeren, terwijl het hoge resolutie, genoombrede mapping van TF's en chromatine-geassocieerde eiwittenbiedt 13 . CUT&RUN vertrouwt op de gerichte vertering van chromatine in gepermeabiliseerde kernen met behulp van vastgebonden microkokkennucleasen, gevolgd door sequencing van de verteerde DNA-fragmenten 9,10. Aangezien DNA-fragmenten specifiek worden gegenereerd bij de loci die gebonden zijn door een eiwit van belang, in plaats van door het hele genoom te worden gegenereerd via willekeurige fragmentatie zoals in ChIP-assays, resulteert de CUT & RUN-benadering in sterk verminderde achtergrondsignalen en vereist dus 1/10e van de sequencingdiepte in vergelijking met ChIP-seq11,13, 14. Deze verbeteringen leiden uiteindelijk tot aanzienlijke verlagingen van de sequencingkosten en vermindering van het totale aantal inputcellen dat nodig is als uitgangsmateriaal voor elk monster.

Hier wordt een robuust CUT&RUN-protocol beschreven dat is aangepast en geoptimaliseerd voor het bepalen van de genoombrede lokalisatie van TF's in C. albicans-cellen geïsoleerd uit biofilms en planktonculturen. Een grondige pijplijn voor gegevensanalyse wordt ook gepresenteerd, die de verwerking en analyse van de resulterende sequentiegegevens mogelijk maakt en vereist dat gebruikers minimale expertise hebben in codering of bio-informatica. In het kort beschrijft dit protocol epitoop-tagging van TF-coderende genen, het oogsten van biofilm- en planktoncellen, isolatie van intacte permeabiliseerde kernen, incubatie met primaire antilichamen tegen het specifieke eiwit of epitoop-gelabelde eiwit van belang, tethering van de chimere A / G-microkokkenkernen (pAG-MNase) fusie-eiwitten aan de primaire antilichamen, genomisch DNA-herstel na chromatinevertering en voorbereiding van genomische DNA-bibliotheken voor sequencing.

Het experimentele CUT&RUN-protocol wordt gevolgd door een speciaal gebouwde pijplijn voor gegevensanalyse, die ruwe DNA-sequencing leest in FASTQ-formaat en alle vereiste verwerkingsstappen implementeert om een volledige lijst te bieden van aanzienlijk verrijkte loci gebonden door de TF van belang (gericht op het primaire antilichaam). Merk op dat meerdere stappen van het beschreven bibliotheekvoorbereidingsprotocol specifiek zijn aangepast en geoptimaliseerd voor CUT & RUN-analyse van TF's (in tegenstelling tot nucleosomen). Hoewel de gegevens in dit manuscript werden gegenereerd met behulp van TF-specifieke aanpassingen van een commerciële CUT & RUN-kit, zijn deze protocollen ook gevalideerd met behulp van individueel geproduceerde componenten (d.w.z. pAG-MNase-enzym en magnetische DNA-zuiveringsparels) en in-house voorbereide buffers, die de experimentele kosten aanzienlijk kunnen verlagen. De uitgebreide experimentele en data-analyseprotocollen worden hieronder in detail beschreven in een stap-voor-stap formaat. Alle reagentia en kritieke apparatuur, evenals buffer- en mediarecepten, worden vermeld in respectievelijk de tabel met materialen en aanvullend dossier 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Epitoop Tagging van C. albicans stammen

  1. Upload het gen van belang, samen met zijn 1 kb stroomopwaartse en stroomafwaartse flankerende sequenties, van de Candida Genome Database naar de primer-ontwerptool (zie de tabel met materialen). Ontwerp een geleidings-RNA (gRNA) door 50 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van het stopcodon te markeren en klik op het gRNA-selectiegereedschap aan de rechterkant. Selecteer Ontwerp- en analysehandleidingen. Gebruik het Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploïde)) genoom en een NGG (SpCas9, 3' side) protospacer adjacent motif (PAM) voor de gidsparameters en klik op Finish. Figuur 1 beschrijft de workflow voor epitoop die een C. albicans-gen van belang tagt met verbeterd groen fluorescerend eiwit (eGFP).
    1. Bevestig op de volgende pagina het doelgebied voor gRNA-ontwerp en druk op de groene knop. Sorteer gRNA's op basis van de on-target score.
      OPMERKING: De primer-ontwerptool berekent on-target en off-target scores om de specificiteit van de gRNA's te kwantificeren. Een ideale gids heeft een on-target score van >60, een off-target score van ~33, en overlapt het stopcodon. Dit maakt een hoge gRNA-specificiteit mogelijk, terwijl gRNA-targeting na GFP-integratie wordt afgebroken. Een gRNA met een off-target score van ~50 duidt op allelische variatie; er zal dus slechts één allel door het gRNA worden herkend.
    2. Voeg de sequenties (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') en (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') toe aan respectievelijk de 5' en 3' uiteinden van de 20 bp gRNA-doelsequentie, waardoor een 60 bp primer/oligonucleotide ontstaat. U kunt ook de 20 bp-sequentie kopiëren naar de gRNA-calculator van Nguyen et al.15. Bestel het 60 bp custom gRNA oligonucleotide.
    3. Versterk het "universele A-fragment" met 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') en 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') en het "unieke B-fragment" met het aangepaste 60 bp gRNA oligonucleotide (100 mM) uit stap 1.1.2. en 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3') met respectievelijk pADH110 (plasmide repository ID# 90982) en pADH139 (plasmid repository ID# 90987), als sjabloon-DNA. Gebruik de PCR-reactie- en fietscondities in tabel 1.
      OPMERKING: pADH139 is specifiek voor stammen die de heterologe Candida maltosa LEU2 marker dragen. Bij gebruik van een stam met een enkele kopie van het C. albicans LEU2-gen , vervang pADH119 (plasmide repository ID# 90985) in plaats van pADH139.
    4. Bevestig een geslaagde versterking door 5 μL van de PCR te controleren op een 1% agarosegel. Zoek naar ~1 kb A en B fragment amplicons.
    5. Meng 1 μL elk van de A- en B-fragmenten en naai ze aan elkaar met behulp van de PCR-reactie- en fietsomstandigheden in tabel 2 om een C-fragment over de volledige lengte te creëren.
    6. Voeg 0,5 μL van 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') en 0,5 μL van 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') toe aan elke PCR-reactie, meng goed door pipetteren en voltooi de in tabel 3 vermelde fietsomstandigheden.
      OPMERKING: Als u pADH119 gebruikt in plaats van pADH139, vervangt u AHO1238 (5'-TGTATTTTGTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') in plaats van AHO1453.
    7. Bevestig de juiste hechting en versterking van het C-fragment door 5 μL van de PCR te controleren op een 1% agarosegel. Zoek naar een ~2 kb amplicon. Bewaar het C-fragment bij -20 °C tot het klaar is voor gebruik.
      OPMERKING: Als stiksel en versterking resulteren in meerdere, niet-specifieke banden of uitstrijkjes, voert u een PCR-opschoning uit van de A- en B-fragmenten en herhaalt u stap 1.1.5.
  2. Voeg de volledige CTG-geoptimaliseerde monomere eGFP met linkersequentie (RIPLING)16 (pCE1, plasmid repository ID# 174434) onmiddellijk stroomopwaarts van het stopcodon van het gen van belang toe met behulp van de primer-ontwerptool, waardoor een C-terminal translationele fusie ontstaat. Gebruik deze constructie om oligonucleotiden te ontwerpen voor het versterken van het donor-DNA (dDNA) van pCE1.
    1. Ontwerp een voorwaarts oligonucleotide met 18-22 bp homologie aan de linkersequentie en >50 bp homologie aan het 3' einde van het open leesframe (ORF).
      OPMERKING: De homologie van 18-22 bp creëert een gloeitemperatuur voor versterking tussen 55 °C en 58 °C. Als het oligonucleotide over de volledige lengte primerdimeren vormt, pas dan de homologie aan de linkersequentie /GFP of het genoom dienovereenkomstig aan.
    2. Creëer een omgekeerd oligonucleotide met 18-22 bp homologie aan het 3' einde van GFP en >50 bp homologie aan de stroomafwaartse niet-coderende sequentie van de ORF die moet worden gelabeld.
    3. Bestel deze oligonucleotiden en versterk het dDNA met behulp van de meegeleverde touchdown PCR-fietscondities in tabel 4.
  3. Ontwerp twee sets kolonie PCR (cPCR) oligonucleotiden voor het bevestigen van de integratie van GFP door te versterken over de flankerende integratiesites. Selecteer eerst het voorwaartse dDNA-oligonucleotide met behulp van de primerontwerptool en klik op de knop Primer aan de rechterkant.
    1. Klik op Primers-| maken Wizard | Tm Param en bevestig dat het algoritme is ingesteld op SantaLucia 1998. Klik op Selectie gebruiken om de coördinaten van het voorwaartse oligonucleotide in 1.2.1 in te voeren als doelsequentie.
    2. Stel de optimale primertemperatuur in op 55 °C en de maximale amplicongrootte op 900 bp en klik op de knop Primers genereren in de rechterbovenhoek.
    3. Selecteer het oligonucleotidepaar met de laagste strafscore en bevestig dat de primers versterken op de 5'-integratiesite. Zorg ervoor dat de voorwaartse cPCR-primer stroomopwaarts van de voorwaartse dDNA-primersequentie en de omgekeerde cPCR-primer volledig binnen de eGFP-tag of de linkervolgorde ligt.
    4. Herhaal stap 1.3-1.3.3. met het omgekeerde dDNA-oligonucleotide om de tweede set cPCR-oligonucleotiden te creëren die over de 3'-integratiesite versterken. Zorg ervoor dat de voorwaartse cPCR-primer volledig binnen de eGFP-tag of de linkersequentie ligt en de omgekeerde cPCR-primer stroomafwaarts van de omgekeerde dDNA-primersequentie.
    5. Bestel deze oligonucleotiden.
  4. Verteer 2.500 ng pADH140, dat Cas9 (plasmide repository ID # 90988) bevat, met restrictie-enzym voor elk gen dat GFP-gelabeld moet zijn. Stel het totale volume van elke spijsvertering in op 15 μL; pas het watervolume dienovereenkomstig aan op basis van de pADH140-plasmideconcentratie. Gebruik de in tabel 5 gespecificeerde verteringsomstandigheden. Bewaar het verteerde plasmide bij -20 °C tot het klaar is voor gebruik.
    OPMERKING: Als een stam wordt getransformeerd met een enkele kopie van het C. albicans LEU2-gen , in plaats van de heterologe C. maltosa LEU2-marker , vervang dan pADH137 (plasmide repository ID # 90986) in plaats van pADH140.
  5. Denatureer 12 μL van 10 mg/ml zalmsperma-DNA voor elk gen dat gedurende 10 minuten GFP-gelabeld wordt bij 99 °C en snel afkoelt tot ≤4 °C. Bewaren bij -20 °C tot het klaar is voor gebruik.
  6. Streak een C. albicans LEU2 hemizygous nourseothricin-gevoelige stam op gist pepton dextrose (YPD) platen en incubeer bij 30 °C gedurende twee dagen.
  7. Selecteer een enkele kolonie en breng deze over naar 4 ml vloeibare YPD. Incubeer gedurende 12-16 uur bij 30 °C met schudden bij 250 tpm.
  8. Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van de nachtelijke (12-16 h) cultuur in een spectrofotometer met behulp van een wegwerp cuvette (1 ml, 1 cm padlengte).
  9. Verdun de nachtkweek in een Erlenmeyer tot een OD600 van 0,1 in YPD. Neem rekening met 5 ml per reactie en neem een extra 5 ml op voor het later controleren van de OD600 .
    OPMERKING: Het volume van de cultuur hangt af van het aantal transformatiereacties.
  10. Incubeer de verdunde nachtkweek in een schudincubator bij 30 °C met schudden bij 250 tpm totdat deze een OD600 van 0,5-0,8 bereikt.
  11. Centrifugeer bij 4.000 × g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten; verwijder en gooi het supernatant weg.
  12. Resuspend de celkorrel in 1 ml steriel water via zachte pipetmenging met filterpunten en breng over in een steriele microfugebuis van 1,5 ml.
  13. Pellet de cellen door 1 min te centrifugeren bij 4.000 × g bij kamertemperatuur; verwijder en gooi het supernatant weg. Resuspend in 1 ml steriel water en herhaal dit gedurende in totaal twee wasbeurten.
  14. Resuspend de pellet in 1/100e van het volume dat in stap 1.10 is gebruikt. Als bijvoorbeeld 15 ml werd gebruikt, resuspendeert u de pellet in 150 μL steriel water.
  15. Meng in een aparte buis voor elke transformatiereactie 50 μL C-fragment, 50 μL dDNA, 2.500 ng restrictie-enzym-verteerde pADH140 en 10 μL gedenatureerd zalmsperma-DNA.
  16. Voeg 50 μL van de celdrijfmest uit stap 1.14 toe en meng door pipetteren.
  17. Maak een voorraad van de plaatmix (Aanvullend bestand 1) voor n + 1 transformaties.
  18. Voeg 1 ml van het plaatmengsel toe aan het cel/DNA-mengsel en meng door 5 keer om te keren.
    OPMERKING: Tik op de bodem van de buizen terwijl u omkeert om de resterende vloeistof los te maken.
  19. Plaats het mengsel 's nachts in een incubator bij 30 °C (12-16 uur) zonder te schudden.
  20. Hitte-shock de cellen gedurende 15 minuten bij 44 °C in een waterbad.
  21. Centrifugeer de 1,5 ml microfugebuizen bij 5.000 × g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
  22. Verwijder het PLATE-mengsel door vacuümaspiratie met behulp van steriele pipetpunten, waarbij u voorzichtig bent om te voorkomen dat de celkorrel wordt verstoord.
  23. Resuspend de celkorrel in 1 ml YPD, pellet door centrifugeren bij 4.000 × g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut, en verwijder en gooi het supernatant weg. Herhaal dit voor een tweede wasbeurt, resuspend de celkorrel in 1 ml YPD en breng de suspensie over naar een 10 ml ronde bodem, wegwerpcultuurbuis met nog eens 1 ml YPD (2 ml eindvolume). Herstel de cellen bij 30 °C met schudden bij 250 tpm gedurende 5 uur.
  24. Centrifugeer de buizen bij 4.000 × g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten; verwijder en gooi het supernatant weg.
  25. Resuspend de celkorrel in 100 μL steriel water en plaat op YPD aangevuld met 200 μg/ml nourseothricine (NAT200). Incubeer bij 30 °C gedurende 2-3 dagen.
  26. Aliquot 100 μL van 20 mM NaOH in de putten van een 96-well PCR-plaat, waarbij elke put overeenkomt met een individuele kolonie die op de NAT200-platen groeide. Kies met behulp van een steriele tandenstoker of pipetpunt individuele getransformeerde kolonies, plak ze op een nieuwe NAT200-plaat en draai de resterende cellen in een put met 20 mM NaOH. Herhaal dit voor de resterende kolonies om het cellysaat te maken dat wordt gebruikt als het DNA-sjabloon voor de cPCR-reactie.
  27. Sluit de PCR-plaat af en incubeer gedurende 10 minuten bij 99 °C in een thermocycler met een verwarmd deksel.
  28. Stel twee cPCR-reacties in met de oligonucleotiden die zijn ontworpen in stappen 1.3-1.3.5. Schaal het aantal reacties indien nodig op. Voer de PCR-reactie uit met het cellysaat dat is bereid in stap 1.26 volgens de cyclusomstandigheden en PCR-reactiemengsels uit tabel 6. Laat 10-20 μL uit elke put lopen op een 1% agarose gel. Zoek naar kolonies met versterking van de twee cPCR-primersets die wijzen op de juiste geïntegreerde GFP dDNA.
  29. Restreak kolonies die GFP bevatten op synthetische complete (SC) media zonder leucine. Incubeer in een incubator van 30 °C gedurende 2-3 dagen. Kies individuele kolonies en patch op YPD en YPD aangevuld met 400 μg / ml nourseothricin (NAT400) platen. Identificeer kolonies die na 24 uur niet op NAT400-platen groeien als kolonies die met succes de CRISPR-componenten hebben verloren.
  30. Controleer of de GFP-tag behouden blijft door stap 1.25-1.28 te herhalen met cellen van de YPD-patchplaat. Als de juiste banden aanwezig zijn, ent u in 4 ml YPD en groeit u 's nachts (12-16 uur), zoals beschreven in stap 1.7.
  31. Meng de nachtkweek van de nieuwe GFP-gelabelde stam met filter-gesteriliseerde 50% glycerol in een verhouding van 1:1 in een steriele cryobuis. Bewaren bij -80 °C en indien nodig opnieuw inbouwen op YPD-platen.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de GFP-gelabelde stammen te valideren door nucleaire lokalisatie van de gelabelde TF te bevestigen via fluorescerende microscopie en een wild-type fenotype te bevestigen in een geschikte fenotypische assay.

2. Monstervoorbereiding van biofilmculturen

  1. Streep C. albicans GFP-gelabelde stam(en) op YPD-agarplaten en incubeer bij 30 °C gedurende 2-3 dagen. Gebruik een enkele geïsoleerde kolonie van de agarplaat en ent in 4 ml YPD vloeibaar medium. Incubeer bij 30 °C met schudden een nacht (12-16 uur). Bepaal de OD600 van de nachtcultuur(en).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om drie biologische replicaties per monster te gebruiken voor de CUT& RUN-experimenten.
  2. Ent een steriele 12-well onbehandelde celkweekplaat met de nachtkweek tot een uiteindelijke OD600 van 0,5 (equivalent aan 2 × 107 cellen / ml) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium tot een eindvolume van 2 ml. Incubeer gedurende 90 minuten bij 37 °C in een microplaatincubator met schudden bij 250 tpm.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om één 12-well celkweekplaat per stam te gebruiken met één put niet-geïnenculeerd als een medium-alone contaminatiecontrole. Dit protocol is met succes toegepast met slechts 1/10e van één 12-well celkweekplaat goed (of zo weinig als 5 miljoen cellen). Het gebruik van een hoger aantal cellen verhoogt de totale DNA-opbrengst, wat meestal resulteert in hoogwaardige sequencingbibliotheken.
  3. Verwijder niet-bevestigde cellen door aspiratie met behulp van steriele pipetpunten die via flexibele plastic buizen aan een vacuümvangerapparaat zijn bevestigd. Was de aangehechte cellen eenmaal met 2 ml steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 2 ml verse RPMI-1640 medium toe aan de putten en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C met schudden bij 250 tpm.
    OPMERKING: Wissel pipetpunten tussen putjes van verschillende stammen en/of omstandigheden. Schraap de bodem van de put niet met de punt tijdens het aspirateren.
  4. Aan het einde van de 24-uurs incubatie verzamelt en bundelt u het vloeibare en biofilmmateriaal uit elk van de 11 ingeënte putten in een enkele, steriele conische buis van 50 ml. Herhaal dit indien nodig met onafhankelijke pools als u meer dan één stam of groeiconditie tegelijkertijd verwerkt.
    OPMERKING: Schraap de bodems en randen van elke put met een pipetfilterpunt om cellen los te maken die aan het oppervlak blijven kleven. Gebruik de pipet om de biofilms te homogeniseren.
  5. Pelletmonsters door centrifugeren bij 4.000 × g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Decanteer zoveel mogelijk van het supernatant en zorg ervoor dat verstoring van de pellet tot een minimum wordt beperkt. Vries de pellet in vloeibare stikstof in en bewaar deze onmiddellijk na het verzamelen bij -80 °C of ga direct verder met stap 4 (isolatie van kernen).

3. Monstervoorbereiding van planktonculturen

  1. Streep C. albicans GFP-gelabelde stam(en) op YPD-agarplaten en incubeer bij 30 °C gedurende 2-3 dagen. Gebruik een enkele geïsoleerde kolonie van de agarplaat en ent in 4 ml YPD vloeibaar medium. Incubeer bij 30 °C met schudden een nacht (12-16 uur). Bepaal de OD600 van de nachtcultuur(en).
  2. Verdun de nachtculturen terug tot OD600 van 0,1 in 50 ml RPMI-1640 vloeibaar medium en incubeer bij 30 °C met schudden bij 225 tpm gedurende 2-5 uur tot OD600 tussen 0,5 en 0,8 ligt.
    OPMERKING: Cellen moeten minstens twee verdubbelingen ondergaan voordat ze worden geoogst. De omstandigheden die worden gebruikt voor planktonculturen kunnen indien nodig worden aangepast.
  3. Pelleteer de monsters door ze gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 4.000 × g bij kamertemperatuur. Decanteer zoveel mogelijk van het supernatant en zorg ervoor dat verstoring van de pellet tot een minimum wordt beperkt. Vries de pellet in vloeibare stikstof in en bewaar deze onmiddellijk na het verzamelen bij -80 °C of ga direct verder met stap 4 (isolatie van kernen).

4. Isolatie van kernen

OPMERKING: Bereid op de dag van het experiment verse Ficoll Buffer, voeg 2-mercaptoethanol en proteaseremmer toe aan aliquot(s) van de Resuspension Buffer en voeg proteaseremmer toe aan aliquot(s) van de SPC Buffer (zie Aanvullend Dossier 1). Om de pellets opnieuw te gebruiken, pipetteer voorzichtig met behulp van 200 μL of 1 ml pipetpunten om beschadiging van de cellen of kernen te voorkomen. Voordat u begint met de isolatie van de kernen, zet u het warmteblok aan om het voor te verwarmen tot 30 °C. Alle pipetpunten en -buizen voor de rest van dit protocol moeten DNA/RNA- en DNase/RNase-vrij zijn en het gebruik van filtertips wordt aanbevolen voor alle volgende pipetteerstappen.

  1. Resuspend pellet(s) in 1 ml Resuspension Buffer op kamertemperatuur en breng over in een steriele microfugebuis van 1,5 ml. Pellet bij 2.000 × g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten in een tafelcentrifuge en verwijder het supernatant.
    OPMERKING: Verwijder het supernatant met behulp van een pipetpunt van 200 μL of 1 ml, zodat de pellets tot een minimum worden beperkt.
  2. Resuspend de pellet(s) in 200 μL Resuspension Buffer bij kamertemperatuur. Breng van de geresuspendeerde pellet een aliquot van 5 μL over in een nieuwe PCR-buis en bewaar deze bij 4 °C voor later gebruik.
    OPMERKING: Dit aliquot zal worden gebruikt als een controle tijdens een volgende kwaliteitscontrolestap om de kwaliteit van de geïsoleerde kernen te evalueren.
  3. Pellet met 2.000 × g gedurende 2 minuten en verwijder en gooi het supernatant weg met een pipet. Herhaal de wasstap tweemaal met 200 μL Resuspension Buffer.
  4. Centrifugeer bij 2.000 × g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant. Voeg 300 μL Resuspension Buffer en 10 μL lyticase-oplossing (50 mg/ml, zie de tabel met materialen) toe. Incubeer gedurende 30 min bij 30 °C in een warmteblok.
    OPMERKING: Als alternatief kan een waterbad verwarmd tot 30 °C ook worden gebruikt in plaats van een warmteblok. De sferoplastingcondities die hier worden gebruikt, zijn geoptimaliseerd om effectief te zijn voor zowel gist- als hyphalcellen van C. albicans. Het wordt aanbevolen om de sferoplastingsomstandigheden te optimaliseren bij het toepassen van dit protocol op C. albicans-cellen met mutaties die de integriteit van de celwand of andere cellulaire morfologieën beïnvloeden. Tijdens deze incubatiestap van 30 minuten heeft de gebruiker de mogelijkheid om stap 5 (Concanavalin A Bead Activation) van tevoren te voltooien om tijd te besparen.
    1. KRITIEKE STAP: Breng na de incubatiestap van 30 minuten een aliquot van 5 μL over in een nieuwe PCR-buis. Voeg aan de 5 μL geïsoleerde kernen en de 5 μL aliquot van intacte cellen die zijn opgeslagen bij 4 °C vanaf stap 4.2 1 μL calcofluorwit (een fluorescerende celwandkleurstof) en 1 μL SYTO 13 (een nucleïnezuurkleuring) toe. Incubeer bij 30 °C in het donker gedurende 30 minuten.
    2. Inspecteer visueel de integriteit en zuiverheid van de geïsoleerde kernen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Zoek naar geïsoleerde kernen die prominent gekleurde intacte kernen vertonen (met behulp van een excitatiefilter van 488-509 nm) en zorg ervoor dat er geen celwandkleuring is door de calcofluorwitte kleurstof (met behulp van een excitatiefilter van 390-420 nm). Zoek in de intacte controlecellen naar prominente celwandkleuring door de calcofluorwitte kleurstof (met behulp van een excitatiefilter van 390-420 nm) en gekleurde intacte kernen (met behulp van een excitatiefilter van 488-509 nm).
  5. Centrifugeer bij 2.000 × g bij 4 °C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspend de pellet in 500 μL ijskoude Resuspension Buffer met behulp van 1 ml filtertips door 5 keer zachtjes op en neer te pipetteren. Centrifugeer bij 2.000 × g bij 4 °C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant met een pipet van 1 ml. Resuspend de pellet met 1 ml vers gemaakte ijskoude Ficoll Buffer.
    OPMERKING: Bewaar de monsters en buffers vanaf dit punt op ijs.
  6. Centrifugeer de monsters bij 5.000 × g bij 4 °C gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Resuspend de pellet in 500 μL ijskoude SPC Buffer.
    OPMERKING: Vanaf dit punt hanteert u de kernen uiterst voorzichtig om beschadiging ervan te voorkomen.
  7. Centrifugeer de monsters bij 5.000 × g bij 4 °C gedurende 10 minuten en verwijder zoveel mogelijk van het supernatant zonder de pellet te verstoren. Plaats de buisjes met de gepelleteerde kernen op ijs en ga verder met stap 5. Als stap 5 in stap 4.4 al van tevoren is voltooid, gaat u verder met stap 6 of vriest u de pellets in vloeibare stikstof in en bewaart u ze onmiddellijk na het verzamelen bij -80 °C.

5. Concanavalin Een kraal activering

OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Vanaf dit punt hebben gebruikers de mogelijkheid om door te gaan met het protocol met behulp van een in de handel verkrijgbare CUT & RUN-kit of afzonderlijke bronsleutelcomponenten en buffers in eigen huis voor te bereiden. Bij gebruik van de commerciële kit zijn alle onderstaande buffers en reagentia inbegrepen in de kit, tenzij anders vermeld. Individuele catalogusnummers voor het onafhankelijk inkopen van reagentia worden ook vermeld in de tabel met materialen. Koel alle buffers op ijs voor gebruik. Zodra stap 5 is voltooid, wordt aanbevolen om onmiddellijk door te gaan naar stap 6. Vermijd meervoudig vries-ontdooien van geïsoleerde kernen, omdat bekend is dat het DNA-schade verhoogt en kan leiden tot resultaten van slechte kwaliteit.

  1. Resuspend de concanavaline A (ConA) kralen voorzichtig met behulp van een pipet. Breng 22 μL ConA-kraalsuspensie over per te verwerken monster in een enkele microfugebuis van 1,5 ml. Plaats de buis op een magnetisch rek totdat de kraalbrij helder is; verwijder het supernatant en gooi het weg met een pipet.
    OPMERKING: Breng bij het uitvoeren van CUT&RUN voor in totaal 10 monsters bijvoorbeeld 220 μL van de ConA-kraalsuspensie over naar een microfugebuis van 1,5 ml.
  2. Verwijder de buis met de ConA-kralen uit het magnetische rek en voeg onmiddellijk 200 μL ijskoude Bead Activation Buffer toe en meng voorzichtig met een pipet. Plaats de buis op het magneetrek totdat de kraalbrij helder is; verwijder het supernatant en gooi het weg met een pipet. Herhaal deze stap voor in totaal twee wasbeurten.
  3. Resuspend de kralen in 22 μL ijskoude Bead Activation Buffer per monster van de te verwerken kernen. Houd de kralen op ijs totdat ze nodig zijn.
    OPMERKING: De doorvoer van de volgende stappen is afhankelijk van het aantal en de capaciteit van de beschikbare magnetische buisrekken. Het verwerken van 32 monsters in twee 16-well buizenrekken is een beheersbaar aantal voor de meeste gebruikers van dit protocol. Een hogere doorvoer is echter mogelijk voor meer ervaren gebruikers, of als er robotachtige vloeistofbehandelingssystemen beschikbaar zijn.

6. Kernen binden aan geactiveerde kralen

OPMERKING: Koel alle buffers op ijs voor gebruik. Alle buffers aangevuld met proteaseremmers moeten vers worden bereid op de dag van het experiment. Het wordt aanbevolen om in de volgende stappen 0,2 ml stripbuizen te gebruiken.

  1. Resuspend de gepelleteerde kernen uit stap 4 in 100 μL ijskoude SPC Buffer en breng over naar een nieuwe 8-buis 0,2 ml strip. Voeg 20 μL van de geactiveerde kralen toe aan elk monster en pipetteer voorzichtig om te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten zonder te roeren.
  2. Plaats de buizen op het magneetrek totdat de drijfmest helder is; verwijder het supernatant en gooi het weg met een pipet. Verwijder de buizen uit het magneetrek en voeg 200 μL ijskoude wasbuffer toe aan elk monster. Resuspend de kralen door 5 keer zachtjes op en neer te pipetteren. Breng 100 μL aliquots van elk monster over in een nieuwe 8-buiss strip van 0,2 ml.
    1. KRITISCHE STAP: Verdeel elk CUT&RUN-monster in twee afzonderlijke aliquots. Gebruik een van de aliquots voor het negatieve controleantilichaam (bijv. IgG-negatief controle-antilichaam) en de andere voor het doelantilichaam tegen het eiwit van belang (bijv. Anti-GFP-antilichaam).
      OPMERKING: Beide monsters zijn vereist voor de computationele pijplijn om verrijkingssignalen die specifiek zijn voor de TF van belang nauwkeurig te identificeren. Een extra controle met anti-GFP-antilichamen met een niet-gelabelde stam kan ook worden uitgevoerd. Deze controle heeft resultaten laten zien die vergelijkbaar zijn met het gebruik van IgG-antilichamen in een GFP-gelabelde stam. Daarom wordt het voor de eenvoud aanbevolen om de standaard IgG-controle voor alle experimenten te gebruiken.

7. Primaire antilichaambinding

OPMERKING: pAG-MNase fusie-eiwit bindt goed aan konijn, geit, ezel, cavia en muis IgG-antilichamen17. Over het algemeen zijn de meeste commerciële ChIP-seq-gecertificeerde commerciële antilichamen compatibel met CUT&RUN-procedures. De hoeveelheid primair antilichaam die wordt gebruikt, hangt af van de efficiëntie van het antilichaam en titratie van het antilichaam (bijv. 1:50, 1:100, 1:200 en 1:400 eindverdunning) kan nodig zijn als het betreffende antilichaam niet eerder is getest in ChIP- of CUT&RUN-experimenten. Koel alle buffers voor gebruik af op ijs. Alle buffers die worden gebruikt voor antilichaambindende stappen moeten op de dag van het experiment vers worden bereid.

  1. Plaats de buizen op een magnetisch rek en wacht tot de slurry helemaal helder is; verwijder het supernatant en gooi het weg met een pipet. Voeg 50 μL van de antilichaambuffer toe en meng voorzichtig door te pipetteren.
  2. Voeg 3 μL van het anti-GFP polyklonale antilichaam toe (of 0,5 μg bij gebruik van een niet-getest antilichaam). Incubeer de buizen op een notenmixer bij 4 °C gedurende 2 uur.
    OPMERKING: Sommige CUT&RUN-protocollen melden een verhoogde opbrengst door toevoeging van een secundair antilichaam voorafgaand aan pAG-MNase-toevoeging14; er werd echter geen significante verbetering waargenomen met behulp van deze toegevoegde stap en daarom is deze niet opgenomen in dit protocol.
  3. Centrifugeer de buizen kort bij 100 × g bij kamertemperatuur gedurende 5 s, plaats de buizen op een magnetisch rek en zodra de slurry helder is, verwijdert en gooit u het supernatant weg met een pipet. Terwijl de buizen met de kralen zich nog op het magnetische rek bevinden, voegt u 200 μL ijskoude cellpermeabilisatiebuffer rechtstreeks op de kralen toe. Verwijder het supernatant en gooi het weg met een pipet. Herhaal dit voor een totaal van twee wasbeurten met de ijskoude Celpermeabilisatie buffer.
  4. Voeg 50 μL ijskoude cellpermeabilisatiebuffer toe aan elke buis en meng voorzichtig door te pipetteren.
    OPMERKING: Kralen worden vaak op dit punt samengevoegd, maar kunnen gemakkelijk worden gedispergeerd door voorzichtig te mengen met een pipet van 200 μL.

8. Binding van pAG-MNase aan antilichaam

  1. Voeg 2,5 μL van de pAG-Mnase (20x bouillon) toe aan elk monster en meng voorzichtig door te pipetteren. Plaats de monsters (iets verhoogd onder een hoek van ~45° ) op een nutator bij 4 °C. Zet de nutator aan en incubeer de monsters gedurende 1 uur.
  2. Centrifugeer de stripbuizen kort bij 100 × g bij kamertemperatuur gedurende 5 s, plaats de buizen op een magnetisch rek en verwijder, zodra de slurry helder is, het supernatant met een pipet en gooi het weg.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang. Carryover-antilichaam dat na deze stap in de dop of zijkanten van de buizen achterblijft, zal de hoeveelheid achtergrondsignaal aanzienlijk verhogen.
  3. Terwijl de buizen met de kralen zich nog op het magnetische rek bevinden, voegt u 200 μL ijskoude celpermeabilisatiebuffer toe, laat u de slurry opruimen en verwijdert u het supernatant met een pipet en gooit u het weg. Herhaal deze stap voor in totaal twee wasbeurten met de celpermeabilisatiebuffer.
  4. Voeg 100 μL van de ijskoude Cell Permeabilization Buffer toe aan de monsters en pipetteer voorzichtig 5 keer op en neer.

9. Gerichte chromatinevertering en -afgifte

  1. Incubeer de buisjes met het(de) monster(s) gedurende 5 minuten in een nat ijsbad. Voeg 3 μL van 100 mM CaCl2 toe aan elk monster met behulp van een meerkanaalspipet. Pipetteer voorzichtig 5 keer op en neer, breng de buizen onmiddellijk terug naar het natte ijsbad en incubeer gedurende 30 minuten.
  2. Voeg 66 μL van de Stop Buffer toe aan elk monster en vortex voorzichtig om te mengen. Incubeer monsters gedurende 10 minuten bij 37 °C in een droog bad.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 1,5 pg heterologe E. coli spike-in DNA per monster toe te voegen aan de Stop Buffer. De toevoeging van 1,5 pg E. coli spike-in DNA resulteert in 1.000-10.000 in kaart gebrachte spike-in reads voor 1-10 miljoen in kaart gebrachte experimentele reads14. Het spike-in DNA wordt gebruikt om de sequencingdiepte te kalibreren en is vooral belangrijk voor het vergelijken van monsters in een reeks. De toevoeging van spike-in E. coli wordt ten zeerste aanbevolen, maar is niet essentieel. De commerciële CUT&RUN-kit bevat E. coli spike-in DNA, maar kan ook apart worden gekocht.
  3. Plaats de buizen op het magnetische rek en breng 160 μL van het supernatant over in een microfugebuis van 1,5 ml. Breng 80 μL van het monster over in een nieuwe microfugebuis van 2 ml en bewaar bij -20 °C in het geval dat een back-upmonster nodig is. Ga verder met stap 10 met het monster van 80 μL.

10. Opruimen van verzamelde DNA-monsters

OPMERKING: Incubeer DNA-zuiveringsparels bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten voor gebruik. Prechill 100% isopropanol op ijs. Pipetteer bij het mengen van de monsters 10 keer op en neer.

  1. Vortex DNA-zuiveringskralen om de kraalsuspensie te homogeniseren. Voeg 50 μL (~0,6x monstervolume) van de geresuspendeerde kralen toe aan elk monster. Pipetteer en incubeer de monsters op een nutator gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: De verhouding tussen DNA-zuiveringsparels en het gebruikte monster is van cruciaal belang. Met behulp van 0,6x volume DNA-zuiveringskraaloplossing ten opzichte van het monster kunnen de magnetische kralen binden aan grote DNA-fragmenten die vrijkomen uit beschadigde kernen. CUT&RUN-verrijkte DNA-fragmenten zijn veel kleiner dan deze grote DNA-fragmenten en worden dus bij deze stap in het supernatant vastgehouden.
  2. Plaats de buisjes op een magneetrek en breng 130 μL van het supernatant met het DNA over in een 8-buisstrip van 0,2 ml. Voeg nog eens 30 μL DNA-zuiveringsparels toe aan het monster of de monsters (het totale volume is 160 μL).
  3. Voeg 170 μL (~ 1x monstervolume) ijskoude 100% isopropanol toe, meng goed door 10 keer op en neer te pipetteren en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat 100% ijskoud isopropanol wordt gebruikt voor deze stap voor de DNA-zuiveringskralen om de CUT & RUN-verrijkte kleine fragmenten efficiënt te vangen.
  4. Plaats de buizen op het magnetische rek en zodra de brij is opgeruimd, verwijdert u het supernatant voorzichtig en gooit u het weg met een pipet.
  5. Terwijl de buizen zich op het magnetische rek bevinden, voegt u 200 μL vers bereide 80% ethanol op kamertemperatuur toe aan de buizen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg met een pipet. Herhaal deze stap voor een totaal van twee wasbeurten met 80% ethanol.
  6. Draai de buizen snel op 100 × g, plaats de buizen terug op het magnetische rek en verwijder eventuele resterende ethanol met een pipet nadat de slurry is opgeruimd. Droog de kralen gedurende 5 minuten aan de lucht terwijl de buizen op het magnetische rek blijven met het deksel open.
    OPMERKING: Overschrijd de droogtijd niet langer dan 5 minuten, omdat dit de uiteindelijke DNA-opbrengst aanzienlijk kan verminderen.
  7. Verwijder de buisjes uit het magneetrek en eluteer het DNA van de kralen door 17 μL 0,1x Tris-EDTA (TE) toe te voegen bij pH 8. Meng goed en incubeer de buisjes gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  8. Plaats de buizen op het magneetrek totdat de drijfmest helder wordt. Zodra de drijfmest is opgeruimd, brengt u voorzichtig 15 μL van het supernatant over in een steriele PCR-buis van 0,2 ml.
  9. Meet de concentratie van het verzamelde DNA met behulp van een fluorometer volgens het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: Meestal is de concentratie van het verzamelde DNA ~ 1 ng / μL. Soms is de concentratie van het verzamelde DNA te laag om te kwantificeren met behulp van een fluorometer. Dit is geen indicator van een mislukt experiment. Ga verder met de bibliotheekvoorbereiding, ongeacht de concentratie van het verzamelde DNA.
  10. Ga verder met stap 11 of bewaar de monsters bij -20 °C tot ze klaar zijn.

11. Bibliotheekvoorbereiding voor sequencing

OPMERKING: Voor de volgende stappen wordt een in de handel verkrijgbare bibliotheekvoorbereidingskit gebruikt. Wanneer u stappen uitvoert met de Ligation Master Mix, minimaliseert u het aanraken van de buizen en houdt u ze altijd op ijs.

  1. Gebruik 0,1x TE bij pH 8 om het totale volume van het CUT&RUN DNA op 50 μL te brengen. Maak een mastermix van 3 μL End Prep Enzyme Mix en 7 μL End Prep Reaction Buffer per monster. Voeg 10 μL mastermix toe aan het CUT&RUN DNA en meng grondig door 5 keer op en neer te pipetteren.
  2. Voer een snelle spin uit bij 100 × g om alle vloeistof van de zijkanten van de buis te verzamelen. Plaats de buizen in een thermocycler met het verwarmde deksel ingesteld op ≥75 °C en voer de fietsomstandigheden in tabel 7 uit.
    OPMERKING: Afhankelijk van de dna-uitgangsconcentraties die vanaf stap 10 zijn verzameld, volgt u de vereiste adapterverdunning uit tabel 8.
  3. Voeg per monster 2,5 μL adapter toe en meng grondig door 10 keer op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de adapter aan het monster wordt toegevoegd en grondig wordt gemengd voordat de ligatiemastermix wordt toegevoegd.
  4. Maak een mastermix van 30 μL Ligation Master Mix en 1 μL Ligation Enhancer. Voeg 31 μL van het mastermengsel toe aan het (de) monster(s). Meng grondig door 10 keer op en neer te pipetteren.
  5. Incubeer bij 20 °C gedurende 15 minuten in een thermocycler met het verwarmde deksel eraf.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat monsters op ijs worden bewaard en pas naar de thermocycler worden overgebracht nadat de thermocycler 20 °C heeft bereikt.
  6. Voer een snelle spin uit bij 100 × g om alle vloeistof van de zijkanten van de buis te verzamelen, voeg 3 μL Uracil Excision Enzyme toe en incubeer de buizen in de thermocycler bij 37 °C gedurende 15 minuten met het verwarmde deksel ingesteld op ≥47 °C.
    OPMERKING: Dit is een veilige stopplaats; bewaar de monsters bij -20 °C of ga direct verder met stap 11.7. Als u direct doorgaat naar stap 11.7, incubeer dan de DNA-zuiveringsparels bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten voor gebruik.
  7. Voeg 154,4 μL (~1,6x monstervolume) van de DNA-zuiveringsparels toe aan de adapterligatiereactie uit stap 11.6. Pipetteer en incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Plaats de buizen op het magneetrek en zodra de drijfmest is opgeruimd, verwijdert u het supernatant voorzichtig en gooit u het weg met een pipet.
  9. Voeg 200 μL vers bereide 80% ethanol op kamertemperatuur toe aan de buizen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg met een pipet en herhaal deze stap voor een totaal van twee wasbeurten met 80% ethanol.
  10. Draai de buisjes kort op 100 × g. Plaats de buizen terug op het magnetische rek en verwijder eventueel overgebleven ethanol met een pipet. Droog de kralen gedurende 5 minuten aan de lucht terwijl de buizen op het magnetische rek blijven met het deksel open.
    OPMERKING: Overschrijd de droogtijd niet langer dan 5 minuten, omdat dit de uiteindelijke DNA-opbrengst aanzienlijk kan verminderen.
  11. Verwijder de buisjes uit het magneetrek en eluteer het DNA van de kralen door 17 μL van 0,1x TE bij pH 8 toe te voegen. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Plaats de buizen op het magneetrek totdat de drijfmest helder wordt. Zodra de drijfmest is opgeruimd, brengt u voorzichtig 15 μL van het supernatant over in een steriele PCR-buis van 0,2 ml.
  13. Maak een mastermix van 25 μL DNA Polymerase Master Mix en 5 μL Universal Forward Library Amplification Primer (10 μM) per monster.
    OPMERKING: Bereid een extra monster van de mastermix om rekening te houden met pipetteerverliezen.
  14. Voeg 30 μL van de mastermix toe aan het 15 μL adapter-geligeerde DNA-monster. Voeg 5 μL Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer (10 μM) toe aan elk monster om het uiteindelijke volume op een totaal van 50 μL te brengen. Meng grondig door 10 keer op en neer te pipetteren. Voer de PCR-fietscondities uit in tabel 9.
    OPMERKING: Incubeer de DNA-zuiveringsparels bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten voor gebruik.
  15. Vortex de DNA Zuivering Kralen om te resuspend. Voeg 35 μL (~0,7x monstervolume) van de geresuspendeerde kralen toe aan de PCR-versterkte DNA-monsters. Meng en incubeer de monsters op een nutator gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  16. Plaats de buisjes op het magneetrek en zodra de drijfmest helder is, breng je het supernatant met het DNA over naar een nieuwe 0,2 ml 8-well PCR-stripbuis.
  17. Voeg 119 μL (~1,4x monstervolume) kralen toe aan het monster en meng door 5 keer op en neer te pipetteren. Incubeer de monsters op een nutator gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  18. Plaats de buizen op het magneetrek en zodra de drijfmest is opgeruimd, verwijdert u het supernatant voorzichtig en gooit u het weg met een pipet.
  19. Voeg 200 μL vers bereide 80% ethanol op kamertemperatuur toe aan de buizen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s. Verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg met behulp van een pipet; herhaal de stap voor in totaal twee wasbeurten met 80% ethanol.
  20. Draai de buisjes kort op 100 × g. Plaats de buizen terug op het magnetische rek en verwijder eventueel overgebleven ethanol met een pipet. Droog de kralen gedurende 5 minuten aan de lucht terwijl de buizen op het magnetische rek blijven met het deksel open.
    OPMERKING: Overschrijd de droogtijd niet langer dan 5 minuten, omdat dit de uiteindelijke DNA-opbrengst aanzienlijk kan verminderen.
  21. Verwijder de buisjes uit het magneetrek en eluteer het DNA van de kralen door 14 μL van 0,1x TE bij pH 8 toe te voegen. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  22. Plaats de buizen op het magneetrek totdat de drijfmest helder wordt. Zodra de drijfmest is opgeruimd, brengt u voorzichtig 13 μL van het supernatant over in een steriele PCR-buis van 0,2 ml.
  23. Bereid verse 1x Tris-borate-EDTA (TBE) en plaats kant-en-klare, commerciële 10% acrylamide TBE-gel in het gel-elektroforeseapparaat gevuld met 1x TBE.
  24. Voeg in de eerste put 2 μL low-range DNA-ladder toe. Meng 3 μL van 6x ladende kleurstof met 13 μL van het eerder verzamelde monster uit stap 11.22. Voeg voorzichtig 15 μL toe aan elk putje van de gel. Laat de gel 90 min draaien op 70 V.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om één putje in de gel leeg te laten tussen elk monster, omdat dit de kans op kruisbesmetting van het monster vermindert. Ervaren gebruikers kunnen het gepast vinden om alle putten te gebruiken en tegelijkertijd kruisbesmetting zorgvuldig te vermijden, vooral bij het verwerken van een groot aantal monsters.
  25. Verwijder het afgietsel uit de gelbox. Open het gelverband volgens de instructies van de fabrikant, verwijder de gel voorzichtig uit het gelverband en plaats het in een gelhoudbak met 100 ml 1x TBE.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de gel voorzichtig uit het gelverband verwijdert om te voorkomen dat de gel scheurt, omdat deze dun en breekbaar is. Het is van cruciaal belang om handschoenen en de gel met 1x TBE voor te drijven bij het hanteren van de gel. De gelhoudbak moet iets groter zijn dan de grootte van de gel (ongeveer 0,5 "aan elke kant). De kunststof deksels voorzien van 96-well PCR-tube opbergdozen zijn handige opbergbakken voor standaard mini gel maten.
  26. Voeg 10 μL van de nucleïnezuurgelvlek toe aan het bakje en draai zachtjes rond. Dek af met folie ter bescherming tegen licht en incubeer statisch bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  27. Spoel de gel tweemaal af met 100 ml gedeïoniseerd kraanwater. Stel de gel onder blauwlichtverlichting voor met een oranje filterdeksel (figuur 2).
    OPMERKING: Succesvolle bibliotheken tonen een uitstrijkje tussen 100 en 500 bp. Er zal ook een prominente ~ 125 adapter dimeer band zijn. De aanwezigheid van adapterdimeren is geen indicator voor een slechte bibliotheekkwaliteit. Deze hoeveelheid adapterdimeren is onvermijdelijk voor CUT&RUN-experimenten die worden uitgevoerd op TF's met een lage abundantie en is een gevolg van de lage hoeveelheid invoermateriaal die wordt gebruikt om deze bibliotheken voor te bereiden. Gebruik geen ultraviolet licht, dat het DNA kan beschadigen.
  28. Zoals weergegeven in figuur 2, snijdt u voor elke bibliotheek de gel iets boven de ~ 125 bp prominente adapterdimeerband (zorg ervoor dat u de adapterdimeerband niet aanraakt) en onder de laddermarkering van 400 bp.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de ~ 125 adapter dimeer band te vermijden. Zelfs kleine hoeveelheden adapterdimeren zullen de kwaliteit van de bibliotheek aanzienlijk verminderen.
  29. Prik de bodem van een buis van 0,65 ml met een naald van 22 G en plaats de doorboorde buis in een steriele microfugebuis van 2 ml. Breng de gelschijf over naar de doorboorde buis in de microfugebuis van 2 ml.
  30. Centrifugeer de microfugebuis van 2 ml met de doorboorde buis van 0,65 ml en monster gedurende 2 minuten bij 10.000 × g bij kamertemperatuur om de gelbrijf in de microfugebuis van 2 ml te verzamelen.
    OPMERKING: De doorboorde buis moet nu leeg zijn en kan worden weggegooid. Als er nog steeds gel in de doorboorde buis achterblijft, plaatst u de doorboorde buis terug in de 2 ml microfugebuis en centrifugeert u opnieuw bij 10.000 × g bij kamertemperatuur gedurende nog eens 2 minuten.
  31. Voeg aan de gel slurry in de 2 ml microfugebuis 300 μL ijskoude gel-elutiebuffer toe en meng op een nutator bij kamertemperatuur gedurende minimaal 3 uur of 's nachts (12-16 uur).
  32. Breng alle vloeibare en gel slurry over in een filterkolom van 0,22 μm. Centrifugeer bij 10.000 × g bij kamertemperatuur gedurende 1 min; het verzamelde volume moet ~ 300 μL zijn.
  33. Voeg 450 μL (~ 1,5x monstervolume) DNA-zuiveringsparels toe, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op een nutator en plaats het monster vervolgens op het magnetische rek totdat de slurry helder is.
    OPMERKING: Incubeer de DNA-zuiveringsparels bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten voor gebruik.
  34. Verwijder en gooi 500 μL van het supernatant weg en zorg ervoor dat de kralen niet worden verstoord.
  35. Verwijder het monster uit het magneetrek en meng de kralen door 5 keer op en neer te pipetteren. Breng 200 μL van het monster over in een nieuwe PCR-stripbuis.
  36. Plaats de stripbuis op het magneetrek en zodra de slurry is opgeruimd, verwijdert u het supernatant voorzichtig en gooit u het weg met een pipet.
  37. Voeg 200 μL vers bereide 80% ethanol op kamertemperatuur toe aan de buizen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s. Verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg met behulp van een pipet; herhaal deze stap voor in totaal twee wasbeurten met 80% ethanol.
  38. Draai de buisjes kort op 100 × g. Plaats de buizen terug op het magnetische rek en verwijder eventueel overgebleven ethanol met een pipet. Droog de kralen tot 5 minuten aan de lucht, terwijl de buizen op het magnetische rek blijven met het deksel open.
    OPMERKING: Overschrijd de droogtijd niet langer dan 5 minuten, omdat dit de uiteindelijke DNA-opbrengst aanzienlijk kan verminderen.
  39. Verwijder de buisjes uit het magneetrek en eluteer het DNA van de kralen door 17 μL van 0,1x TE bij pH 8 toe te voegen. Meng goed en incubeer de buisjes gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  40. Plaats de buizen op het magneetrek totdat de drijfmest helder wordt. Zodra de drijfmest is opgeruimd, brengt u voorzichtig 15 μL van het supernatant over in een steriele PCR-buis van 0,2 ml.
  41. Meet de uiteindelijke bibliotheekhoeveelheid met behulp van de fluorometer; gebruik deze laatste bibliotheek voor sequencing.
    OPMERKING: Tot 48 bibliotheken kunnen worden samengevoegd en gesequenced in één rijstrook met behulp van een sequencingplatform dat ten minste 300 miljoen 40 bp of langere gepaarde eindlezingen biedt.

12. CUT&RUN sequentie analyse

OPMERKING: In deze sectie wordt het computationele protocol gepresenteerd dat wordt gebruikt om de CUT&RUN-sequentiegegevens te analyseren. Het protocol begint met het instellen van de computationele virtuele omgeving en begeleidt gebruikers bij het uitvoeren van de opdrachten op hun lokale machine. Dit protocol werkt op alle rekenresources, zoals lokale machines, virtuele cloudservers en high-performance computingclusters. Alle CUT&RUN-gegevens die in dit document worden gepresenteerd, zijn toegankelijk bij NCBI GEO onder toetredingsnummer GSE193803.

  1. Download de broncode voor de CUT&RUN analyse van https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
    OPMERKING: De workflow werkt het beste op een MacOS- of Linux OS-systeem. Windows-gebruikers kunnen de workflow uitvoeren met GitBash (zie de tabel met materialen).
    1. Download de code direct van de GitHub-pagina door op de groene knop Code te klikken | Download ZIP-optie . Pak de map uit op een relevante locatie op de lokale computer.
  2. Installeer de Conda-omgeving (zie de tabel met materialen) en voer deze slechts één keer uit.
    OPMERKING: Deze workflow maakt gebruik van de Conda command line tool omgeving om alle benodigde software en tools te installeren.
  3. Zodra Conda is geïnstalleerd (slechts één keer uitvoeren), maakt u een virtuele omgeving met behulp van het aanvullende bestand 2 dat wordt geleverd met de volgende opdracht:
    conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
  4. Activeer de virtuele omgeving telkens wanneer deze workflow moet worden uitgevoerd met behulp van:
    conda activeren
  5. Organiseer de onbewerkte FASTQ-invoerbestanden in één map, idealiter één map per CUT&RUN-experiment.

13. Genereren van het genoombestand voor uitlijning

  1. Genereer het genoombestand voor uitlijning (voer slechts één keer uit voor elk genoombestand). Maak een map om alle genoombestanden van C. albicans op te slaan, zoals:
    mkdir ca_genome_files

14. Downloaden van C. albicans genoomassemblage 21

  1. Download C. albicans genome assembly 21 uit de Candida Genome Database met behulp van wget- of curltools (zie de Tabel met materialen)18.
    OPMERKING: C. albicans assembly 21 werd hier gebruikt om CUT&RUN-resultaten te vergelijken met eerder gepubliceerde ChIP-chipresultaten, die waren afgestemd op Assembly 21. Gebruikers kunnen andere assemblageversies downloaden en vergelijkbare opdrachten uitvoeren om relevante genoombestanden te genereren voor hun uitlijningsbehoeften.

15. Genereer een Bowtie 2 index database (database naam: ca21)

  1. Gebruik het volgende:
    bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
    bowtie2-inspect -s ca21

16. Voer de CUT&RUN-analysepijplijn uit

  1. Lees de Help-sectie om vertrouwd te raken met de parameters van de pijplijn.
    bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Voer het cut_n_run_pipeline.sh bestand uit met relevante parameters

  1. Voer het script uit:
    bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
    OPMERKING: De relevante parameters met gedetailleerde beschrijvingen op regels 19-36 van de code worden beschreven op de GitHub-pagina https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. Organiseer uitvoerbestanden

  1. Voeg significante pieken samen van alle replicaties die door MACS2 worden aangeroepen in /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 met behulp van de BedTools-samenvoegfunctie19.
    cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sort -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last,mean,first,mean,mean,mean > /path/to/merged_output.bed
    OPMERKING: Voor aanvullende informatie en best practices voor het beoordelen van overlappende pieken in replicatiemonsters, verwijzen wij u naar Landt et al.20 en Boyd et al.21.

19. Verwijder overeenkomsten met geblokkeerde genomische regio's met behulp van de BedTools-aftrekfunctie

  1. Gebruik het volgende: subtractBed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
    OPMERKING: De geblokkeerde regio's in het genoom van C. albicans worden verstrekt als een .bed-bestand in aanvullend bestand 3. De lijst bestaat voornamelijk uit zeer repetitieve sequentie-elementen en regio's zoals telomerische herhalingen en centromeren die vaak vals-positieve resultaten opleveren in C. albicans CUT & RUN, ChIP-seq en ChIP-chip datasets. Daarom wordt aanbevolen om de geblokkeerde regio's te verwijderen. Voor bepaalde eiwitdoelen kan het echter ongepast of ongewenst zijn om deze loci uit te sluiten. Gebruikers kunnen deze stap overslaan om signalen in deze geblokkeerde regio's te behouden of hun eigen geblokkeerde regio's te maken.

20. Voeg BigWig-bestanden van replicaties samen met behulp van de UCSC bigWigMerge-functie22

  1. Gebruik het volgende: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
  2. Converteer de BedGraph-uitvoer van bigWigMerge naar BigWig met behulp van de UCSC bedGraphToBigWig-functie.
    bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit robuuste CUT&RUN-protocol werd aangepast en geoptimaliseerd voor het onderzoeken van de genoombrede lokalisatie van specifieke TF's in C. albicans biofilms en planktonculturen (zie figuur 2 voor een overzicht van de experimentele aanpak). Een grondige pijplijn voor gegevensanalyse is ook inbegrepen om de analyse van de resulterende CUT & RUN-sequencinggegevens te vergemakkelijken en vereist dat gebruikers minimale expertise hebben in codering of bio-informatica (zie figuur 3 voor een overzicht van de analysepijplijn). In tegenstelling tot de ChIP-chip en ChIP-seq methoden, wordt CUT&RUN uitgevoerd met behulp van intacte, gepermeabiliseerde kernen bereid uit een aanzienlijk verminderd aantal inputcellen, zonder formaldehyde crosslinking. Het isoleren van intacte kernen van C. albicans sferoplasten is een cruciale stap in het protocol. Efficiënte sferoplasting via de vertering van de C. albicans celwand met behulp van lyticase kan een uitdaging zijn omdat de enzymatische verteringsreactieomstandigheden voor elk celtype moeten worden geoptimaliseerd. Om een succesvol CUT&RUN-experiment met hoogwaardige sequencingresultaten te garanderen, is een vroege kwaliteitscontrolestap inbegrepen en wordt de aanwezigheid van intacte kernen geverifieerd met behulp van een standaard fluorescentiemicroscoop.

Celwandvertering en nucleaire integriteit worden regelmatig beoordeeld door zowel intacte cellen als geïsoleerde kernen gekleurd met fluorescerende celwand en nucleïnezuurvlekken te visualiseren. In tegenstelling tot de geïsoleerde intacte kernen, waar geen celwandkleuring wordt waargenomen, zijn zowel kernen als de celwanden fluorescerend gelabeld in de intacte controlecellen (figuur 4A). Ten slotte wordt voorafgaand aan de sequencing de fragmentgrootteverdeling van CUT&RUN-bibliotheken geëvalueerd met behulp van een capillair elektroforese-instrument. Deze kwaliteitscontrolestap is een betrouwbare maatstaf bij het beoordelen van de kwaliteit van CUT&RUN-bibliotheken. Zoals te zien is in het elektroforesespoor op het bovenpaneel van figuur 4B, vertonen succesvolle bibliotheken die zijn gegenereerd voor experimenten waarbij TF's worden onderzocht, een hoge verrijking voor fragmenten kleiner dan 280 bp. Het elektroforesespoor in het onderste paneel van figuur 4B vertegenwoordigt de resultaten van een mislukt CUT&RUN-experiment.

Hier kwam de piek van ~ 2.000 bp voornamelijk voort uit onverteerd DNA dat vrijkwam uit kernen die uitgebreid beschadigd of gebroken waren tijdens het CUT & RUN-experiment. Het beoordelen van de fragmentgrootteverdeling van de uiteindelijke gepoolde bibliotheken wordt ook aanbevolen om de volledige verwijdering van verontreinigende adapterdimeren te bevestigen (figuur 4C). Doorgaans bieden 5-10 miljoen gepaarde eindlezingen (~ 40 basisleeslengte) per bibliotheek voldoende sequencingdiepte voor de meeste TF CUT & RUN-experimenten in C. albicans. Alternatieve leeslengtes voor sequencing, paired-end of single-end, kunnen worden gebruikt om CUT&RUN-bibliotheken te sequencen. Leeslengtes tussen 25 en 150 bp mogen bijvoorbeeld geen invloed hebben op de kwaliteit van de resultaten. Single-end reads groter dan of gelijk aan 150 bp zouden ook moeten werken voor TF CUT & RUN-experimenten. De bijbehorende pijplijn voor gegevensanalyse moet echter worden aangepast om single-end reads mogelijk te maken.

Dit CUT&RUN-protocol en de bijbehorende pijplijn voor gegevensanalyse werden gevalideerd door twee TF's te onderzoeken, Ndt80 en Efg1, die de vorming van C. albicans-biofilm regelen. Zoals te zien is in figuur 4D, is Ndt80 gebonden aan intergene gebieden (gemarkeerd door de zwarte balken die wijzen op aanzienlijk verrijkte Ndt80 ChIP-chip loci) stroomopwaarts van de EFG1 ORF. Dit intergene gebied stroomopwaarts van EFG1 bleek eerder sterk verrijkt te zijn voor Ndt80-binding tijdens biofilmvorming door ChIP-chip4. Cut&run-experimenten identificeerden echter significant meer pieken binnen deze regio dan ChIP-chipexperimenten (10 pieken versus 4 pieken). Ndt80 DNA-bindingsmotieven zijn verrijkt over alle Ndt80-gebonden loci geïdentificeerd door CUT & RUN (aanvullende figuur 1), wat aangeeft dat de extra pieken die door deze methodologie worden geïdentificeerd waarschijnlijk bonafide Ndt80-gebonden sites zijn. Een systematische vergelijkende analyse gaf aan dat dit gepresenteerde CUT&RUN-protocol met succes de meerderheid van de eerder bekende bindende gebeurtenissen voor Ndt80 en Efg1 tijdens biofilmvorming4 identificeerde (figuur 5).

Bovendien werden veel nieuwe TF-bindingsgebeurtenissen die niet werden vastgelegd in de eerder gepubliceerde ChIP-chipexperimenten geïdentificeerd met behulp van CUT & RUN (figuur 5). Over het algemeen zijn zowel Ndt80 als Efg1 gebonden aan loci overlappen met eerder gepubliceerde ChIP-chipgegevens en aan loci die alleen zijn geïdentificeerd met behulp van de CUT & RUN-methode (overlappingen tussen deze CUT & RUN-gegevens en eerder gepubliceerde ChIP-chipgegevens voor Ndt80 en Efg1 zijn samengevat in de Venn-diagrammen in figuur 5). Bovendien was de fractie van de aflezingen binnen significant genaamde pieken (FRiP-scores) consistent hoger in GFP-gelabelde monsters dan in hun controle-IgG-monsters (zie aanvullende figuur 2). Samenvattend laten deze resultaten zien dat het HIER beschreven CUT&RUN-protocol een robuuste methode is die is geoptimaliseerd om C. albicans TF-DNA-bindingsinteracties van monsters met een lage abundantie te onderzoeken.

Figure 1
Figuur 1: Epitoop tagging van C. albicans TF's. (A) Identificeer een TF-gen van belang (NDT80 in dit geval) en selecteer een gRNA om het snijden van Cas9 (vertegenwoordigd door de oranje vorm) aan het 3'-uiteinde van de ORF te richten. (B) Candida clade-geoptimaliseerde eGFP met >50 bp homologie stroomopwaarts en stroomafwaarts van de cut site zal de dDNA leveren om de DSB te repareren. (C) Gebruik kolonie PCR om individuele kolonies te screenen om de beoogde integratie te bevestigen. Primers worden aangegeven door rode pijlen en amplicons worden aangegeven door onderbroken vakken. Deze figuur is gemaakt met behulp van BioRender.com. Afkortingen: TF = transcriptiefactor; gRNA = gids-RNA; ORF = open leeskader; eGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; DSB = dubbelstrengs breuk; VS = stroomopwaarts; DS = stroomafwaarts. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematisch overzicht van het CUT&RUN experimentele protocol. C. albicans-cellen verzameld uit biofilm- of planktonische kweekomstandigheden worden gepermeabiliseerd om intacte kernen te isoleren. ConA-kralen worden geactiveerd en de intacte kernen worden vervolgens gebonden aan de geactiveerde ConA-kralen. Het antilichaam van belang wordt toegevoegd aan de kraalgebonden kernen en geïncubeerd bij 4 °C. Vervolgens wordt pAG-MNase toegevoegd en mag het binden aan het doelantilichaam. Na de toevoeging van CaCl2 wordt pAG-MNase geactiveerd en gaat gerichte chromatinevertering door tot de toevoeging van het chelaatreagens om pAG-MNase te inactiveren. Het pAG-MNase-gebonden antilichaamcomplex mag uit de gepermeabiliseerde kernen diffunderen en het resulterende DNA wordt geëxtraheerd en gereinigd. Sequencingbibliotheken worden bereid uit de CUT & RUN-verrijkte DNA-fragmenten en de resulterende bibliotheken worden vervolgens uitgevoerd op een 10% PAGE-gel om verontreinigende adapterdimeren te scheiden en te verwijderen voorafgaand aan sequencing. Deze figuur is gemaakt met behulp van BioRender.com. Afkortingen: CUT&RUN = splitsing onder doelen en loslaten met behulp van nuclease; ConA = concanavaline A; PAGE = polyacrylamide gel elektroforese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Schematisch overzicht van de CUT&RUN data analyse pijplijn. De workflow begint met het uitvoeren van kwaliteitscontroles op de onbewerkte FASTQ-bestanden met FastQC, gevolgd door bijsnijden om sequencingadapters te verwijderen. De bijgesneden reads worden vervolgens uitgelijnd met het referentiegenoom en de uitgelijnde reads worden gefilterd op basis van hun grootte om te verrijken voor TF-formaat bindingssignalen (20 bp ≤ uitgelijnde read ≤ 120 bp). Grootte-geselecteerde metingen worden vervolgens gekalibreerd tegen spike-in Escherichia coli-metingen en gekalibreerde metingen worden gebruikt om pieken te noemen met BEHULP VAN MACS2. Het <> symbool is een visuele weergave om aan te geven dat C. albicans leestellingen werden gekalibreerd met behulp van E. coli afgelezen tellingen voor elk monster. Afkortingen: CUT&RUN = splitsing onder doelen en loslaten met behulp van nuclease; TF = transcriptiefactor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Kwaliteitscontrolestappen cruciaal voor succesvolle CUT&RUN-experimenten. (A) Cellen worden gekleurd met fluorescerende celwand (blauw) en nucleïnezuur (groen) vlekken voor en na kernisolatie en gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop. (B) CUT&RUN TF-bibliotheken worden geanalyseerd met behulp van een capillair elektroforese-instrument. Succesvolle CUT&RUN TF-bibliotheken (aangegeven door het groene vinkje) zijn verrijkt voor korte fragmenten kleiner dan 200 bp. Suboptimale CUT&RUN TF-bibliotheken (aangegeven door de rode "X") tonen verrijking voor grote DNA-fragmenten. (C) 48 CUT&RUN-bibliotheken worden samengevoegd en geanalyseerd met behulp van een capillair elektroforese-instrument. Hoogwaardige, gepoolde bibliotheken (aangegeven door het groene vinkje) zijn vrij van adapterdimeren (baan 1), terwijl gepoolde bibliotheken van lage kwaliteit (aangegeven door de rode "X") kleine hoeveelheden adapterdimeren behouden (rijstrook 2). (D) Representatieve IGV-tracks uit CUT&RUN-datasets (inclusief de Ndt80 IgG-controle, bottom track) die een significante verrijking laten zien voor Ndt80-binding (toptrack) in het intergene gebied stroomopwaarts van de EFG1 ORF (Orf19.610). De zwarte balken vertegenwoordigen aanzienlijk verrijkte Ndt80-bindingspieken geïdentificeerd door eerder gepubliceerde ChIP-chipexperimenten4. De blauwe balken vertegenwoordigen aanzienlijk verrijkte Ndt80-bindingspieken die zijn geïdentificeerd in de CUT & RUN-experimenten die hier worden gepresenteerd. Schaalbalken = 50 μm (A). Afkortingen: CUT&RUN = splitsing onder doelen en loslaten met behulp van nuclease; TF = transcriptiefactor; GFP = groen fluorescerend eiwit; ORF = open leeskader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Evaluatie van Ndt80 en Efg1 verrijkte pieken geïdentificeerd met behulp van het gepresenteerde CUT&RUN protocol en data-analyse pijplijn op Candida albicans biofilms. De Venn-diagrammen in de bovenste rij illustreren de mate van overlap tussen Ndt80- en Efg1-bindingslocaties die via CUT&RUN zijn geïdentificeerd met eerder gepubliceerde ChIP-chipgegevens4. De CUT&RUN-signalen voor alle bindingsgebeurtenissen voor Ndt80 en Efg1 worden in de onderste rij weergegeven als gekleurde heatmaps (rood = hoog pieksignaal; blauw = laag/geen pieksignaal; gekleurde balk geeft aan dat het IgG-signaal is afgetrokken van het GFP-signaal); 1.000 bp-regio's stroomopwaarts (-1,0 kb) en stroomafwaarts (+1,0 kb) worden weergegeven in de heatmaps. De signaalintensiteit (d.w.z. verrijking) als profielplot wordt weergegeven boven de heatmaps. Drie biologische replicaties voor Ndt80 en Efg1 werden geëvalueerd voor het visualiseren van de CUT&RUN-verrijking. Afkortingen: ChIP = chromatine immunoprecipitation; CUT&RUN = splitsing onder doelen en loslaten met behulp van nuclease; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: PCR-reactiemix en PCR-cycluscondities om universele A- en unieke B-fragmenten te versterken. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: PCR-reactiemix en PCR-cycluscondities om A- en B-fragmenten te naaien om het C-fragment over de volledige lengte te creëren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: PCR-cyclicondities tot PCR versterken het C-fragment over de volledige lengte. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: PCR-reactiemix en PCR-cycluscondities om de donor-DNA GFP-tag te versterken. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Plasmide verteringsreactie mix en reactiecondities voor de plasmide verteringsreacties. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6: PCR-reactiemix en PCR-cycluscondities voor kolonie PCR. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 7: PCR-fietscondities voor de eindreparatiestap van de bibliotheek ter voorbereiding op de sequencing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 8: Aanbevelingen voor adapterverdunning voor het invoer-DNA om sequencingbibliotheken voor te bereiden. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 9: PCR-cyclicondities voor PCR versterken het adapter-geligeerde DNA. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Ndt80 DNA binding sequence motif enrichment. Cumulatieve Ndt80-motiefverrijkingsscores voor Ndt80-gebonden loci geïdentificeerd in biofilm ChIP-chipgegevens (donkerblauwe stippellijn) of CUT & RUN-gegevens (lichtblauwe stippellijn) vergeleken met willekeurige intergene loci (rode stippellijn). De linker Y-as geeft het percentage van de totale loci aan voor elke dataset die een overeenkomstige cumulatieve motiefscore op de X-as bevat. Stippellijnen geven de betekenis aan van de verrijking van de motiefscore (-log10 P-waarde, rechter Y-as) op elk punt op de X-as, ten opzichte van de willekeurige intergene controleloci. Cumulatieve motiefscores en P-waarden werden bepaald met behulp van MochiView23 (zie Tabel met materialen). Alle Ndt80-gebonden loci werden bemonsterd als 500 bp-vensters gecentreerd onder elke piek van Ndt80-binding binnen de ChIP-chip- en CUT & RUN-datasets en vergeleken met willekeurig geselecteerde 500 bp intergene loci om te controleren op verschillen in lengte. Afkortingen: ChIP = chromatine immunoprecipitation; ChIP-chip = chromatine immunoprecipitatie gevolgd door microarray; CUT&RUN = splitsing onder doelen en loslaten met behulp van nuclease. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Fractie van de metingen binnen een piekscore per steekproef. Staafplot met de FRiP-score voor elke replica. FRiP-scores worden berekend als het aantal in kaart gebrachte reads binnen een piek gedeeld door het totale aantal in kaart gebrachte reads in een CUT&RUN-steekproef. De verschillende staafkleuren vertegenwoordigen individuele biologische replicaatmonsters, zoals aangegeven langs de X-as. Zoals verwacht zijn FRiP-scores van positieve GFP-monsters consistent hoger dan die voor negatieve IgG-monsters. Alle monsters tonen aanvaardbare FRiP-drempels (>1%), volgens de aanbevelingen van Landt et al.20. Afkortingen: FRiP = fractie van de reads binnen een piek; CUT&RUN = splitsing onder doelen en loslaten met behulp van nuclease. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Recepten voor alle gebruikte buffers en oplossingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Bioinformatische tools die nodig zijn voor de pijplijn voor gegevensanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Aanbevolen geblokkeerde regio's in het genoom van C. albicans . Deze lijst van geblokkeerde loci bevat voornamelijk zeer repetitieve sequentie-elementen en regio's zoals telomerische herhalingen en centromeren die historisch gezien vals-positieve resultaten hebben opgeleverd in eerdere genoombrede bindingsexperimenten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol presenteert een uitgebreide experimentele en computationele pijplijn voor genoombrede lokalisatie van regulerende TF's in C. albicans. Het is ontworpen om zeer toegankelijk te zijn voor iedereen met standaard microbiologie en moleculaire biologie training. Door gebruik te maken van het hoge dynamische bereik en de lage sample input vereisten van de CUT&RUN assay en het opnemen van optimalisaties voor de lokalisatie van TF-DNA binding interacties in C. albicans biofilm en planktonic culturen, biedt dit protocol een krachtig en goedkoop alternatief voor traditionele ChIP-seq benaderingen. In vergelijking met ChIP-seq levert CUT&RUN een aanzienlijk hogere gevoeligheid op, met een hoger percentage sequencing-reads die zijn toegewezen aan gebonden pieken, is het vatbaarder voor hoge doorvoer, vereist het aanzienlijk lagere invoercelaantallen, vereist het gebruik van toxische crosslinking-middelen en vereist het tienvoudig minder sequencing-reads per monster om resultaten van hoge kwaliteit te produceren 13,14,17, 23,24. Om de kosten per monster van dit protocol verder te verlagen, zijn buffer- en mediarecepten opgenomen, samen met een gedetailleerde reagenslijst om de interne bereiding van alle benodigde buffers en media te vergemakkelijken, evenals de bulkinkoop van essentiële reagentia. Aangezien C. albicans biofilmvorming, fenotypische switching en commensalisme allemaal worden gereguleerd door complexe verweven transcriptionele netwerken26, biedt dit robuuste, gemakkelijke en kosteneffectieve CUT & RUN-protocol een krachtig nieuw hulpmiddel voor het begrijpen van deze en vele andere cellulaire processen in deze belangrijke menselijke schimmelpathogeen.

TF's zijn niet zo overvloedig als histonen of andere chromatine-geassocieerde eiwitten, wat een unieke uitdaging vormt voor het onderzoeken van TF-DNA-bindingsinteracties via CUT & RUN. Om deze uitdaging aan te gaan, werden kritische aanpassingen en optimalisaties aangebracht aan het standaard CUT&RUN experimentele protocol13. Aangezien de meeste succesvolle CUT&RUN-experimenten gericht op TF's een kleine hoeveelheid DNA opleveren die te verdund is om te kwantificeren en vaak wordt verrijkt voor fragmenten kleiner dan 150 bp13,23, werden de reactieomstandigheden van de bibliotheekvoorbereiding ook geoptimaliseerd om deze kleinere fragmenten te bevoordelen27. Zelfs met deze optimalisatiestap bevatten de resulterende PCR-versterkte bibliotheken een aanzienlijk deel van adapterdiminatoren, die niet volledig worden verwijderd met behulp van op magnetische kralen gebaseerde DNA-grootteselectiemethoden. Om dit probleem op te lossen, is een PAGE-gelgrootteselectiestap opgenomen om definitieve sequencing-ready bibliotheken te genereren die grotendeels verstoken zijn van adapterdimeren. Dit is een cruciale stap van het protocol, omdat het verwijderen van adapterdimeren met behoud van de kleinere TF-afgeleide CUT & RUN-fragmenten essentieel is voor het verkrijgen van hoogwaardige resultaten.

Bovendien filtert de gedetailleerde computationele pijplijn de sequencinggegevens om zich te concentreren op de kleinere metingen afgeleid van TF-DNA-bindingsinteracties in de CUT & RUN-test. Vanwege deze TF-specifieke aanpassingen wordt dit protocol niet aanbevolen voor het profileren van grote chromatine-geassocieerde complexen zoals nucleosomen. Hoewel het theoretisch mogelijk is om het protocol voor dit doel aan te passen door het standaard protocol voor bibliotheekvoorbereiding te volgen dat is meegeleverd met de in de handel verkrijgbare bibliotheekvoorbereidingskit, zou de gebruiker de post-sequencinggrootteselectie in de computationele pijplijn moeten aanpassen. In het bijzonder zouden gebruikers in het gedeelte voor het filteren van grootte in het codebestand cut_n_run_pipeline.sh de huidige waarde van "14400" (120 bp * 120 bp) moeten vervangen door het kwadraat van de gewenste fragmentlengte om de analysepijplijn in staat te stellen de sequencingresultaten te analyseren die zijn gegenereerd voor andere soorten chromatine-DNA-bindingsinteracties.

Een andere belangrijke stap in een succesvol CUT&RUN-experiment is het kiezen van optimale parameters voor post-sequencing data-analyse. Hoewel het grootste deel van de computationele pijplijn is ontworpen om gestandaardiseerd te zijn en van toepassing is op de studie van elke regulerende TF van belang in C. albicans, zijn er twee belangrijke overwegingen die de gebruiker moet evalueren tijdens het uitvoeren van de pijplijn. De eerste overweging is of dubbele reads uit de sequencinggegevens moeten worden opgenomen of verwijderd voordat gebonden doelsites worden geïdentificeerd. Aangezien TF's met een lage abundantie doorgaans sequencinggegevens opleveren met een aanzienlijk percentage leesbewerkingen die zijn afgeleid van PCR-duplicatie tijdens de bibliotheekversterkingsstap, kan het verwijderen van PCR-duplicaten een aanzienlijk negatief effect hebben op de resultaten. Met zeer overvloedige TF's of chromatine-geassocieerde eiwitten vertegenwoordigen PCR-duplicaten echter meestal een kleiner deel van het totale aantal leesbewerkingen en worden ze vaak verwijderd om achtergrondruis in de gegevens te onderdrukken. Uiteindelijk is deze beslissing om PCR-duplicaten te bewaren of te verwijderen afhankelijk van de TF van belang en de diepte van de verkregen sequencinggegevens. De pijplijn genereert dus automatisch onafhankelijke uitvoerbestanden voor gegevens die zijn afgeleid met of zonder PCR-dubbele leesbewerkingen, zodat de gebruiker kan beslissen welke uitvoerbestanden de beste resultaten opleveren voor elk experiment.

De tweede overweging is of problematische loci moeten worden geïdentificeerd en verwijderd die significante, maar zeer variabele verrijking opleveren in zowel experimentele (antilichaam tegen het eiwit van belang) als negatieve controle (IgG) monsters. Het piek-aanroepende algoritme gebruikt MACS2 om significant verrijkte loci te identificeren in zowel de experimentele als de controlemonsters en sluit die uit die welke in beide voorkomen. Hoewel deze aanpak meestal de meeste problematische loci elimineert, verschijnen sommige af en toe als significante pieken in bepaalde experimenten, hoewel eerdere ervaring aangeeft dat het onwaarschijnlijk is dat ze echte positieve sites van TF-verrijking zijn. Er wordt dus een optionele filterstap geboden om deze problematische loci, aangeduid als "blocklisted" loci, te verwijderen. De lijst van geblokkeerde loci bevat voornamelijk zeer repetitieve sequentie-elementen en regio's zoals telomerische herhalingen en centromeren die historisch gezien vals-positieve resultaten hebben opgeleverd in eerdere genoombrede bindingstests. Dit is een zeer conservatieve lijst van loci die met veel vertrouwen als problematisch zijn aangemerkt. Elke gebruiker moet echter van geval tot geval evalueren of dit filter geschikt is voor zijn of haar experiment(en). Een mogelijk alternatief voor de IgG-negatieve controle zou zijn om CUT & RUN uit te voeren tegen een nucleair gelokaliseerd eiwit dat geen DNA bindt. Deze aanpak is een ideale controle gebleken voor ChIP-experimenten28, en een vergelijkbare aanpak is het overwegen waard voor CUT & RUN.

CUT&RUN is een populaire keuze geworden voor het onderzoeken van eiwit-DNA interacties in hogere eukaryoten en de modelgist Saccharomyces cerevisiae. Hier is het met succes aangepast om genoombrede TF-DNA-bindingsinteracties in de klinisch relevante schimmelpathogeen C. albicans te onderzoeken. Dit protocol biedt gedetailleerde methoden voor alle noodzakelijke experimentele en computationele procedures, van de engineering van stammen die epitoop-gelabelde TF's uitdrukken, tot de computationele analyse van de resulterende CUT & RUN-sequencinggegevens. Over het algemeen produceren dit protocol en de bijbehorende data-analysepijplijn robuuste TF-DNA-bindingsprofielen, zelfs bij gebruik van complexe multimorfe populaties van cellen geïsoleerd uit biofilmmonsters met een lage abundantie en biedt het superieure gegevenskwaliteit tegen lagere totale kosten dan ChIP-seq-methodologieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Clarissa J. Nobile is medeoprichter van BioSynesis, Inc., een bedrijf dat diagnostiek en therapieën ontwikkelt voor biofilminfecties.

Acknowledgments

We bedanken alle voormalige en huidige leden van de laboratoria Nobile en Hernday voor feedback op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) award nummer R35GM124594 en door de familie Kamangar in de vorm van een begiftigde leerstoel aan C.J.N. Dit werk werd ook ondersteund door het NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) awardnummer R15AI137975 aan A.D.H.C.L.E. werd ondersteund door het NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) fellowshipnummer F31DE028488. De inhoud is de exclusieve verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de standpunten van de financiers. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript; of in de beslissing om de resultaten te publiceren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Millipore Sigma SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes VWR 490003-190
1 M CaCl2 Fisher Scientific 50-152-341
1 M PIPES Fisher Scientific AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates Corning 351143
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich 60-24-2
2% Digitonin Fisher Scientific CHR103MI
50 mL conical tubes VWR 89039-658
5x phusion HF buffer Fisher Scientific F530S Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar Criterion C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads Beckman Coulter A63880
Agilent Bioanalyzer Agilent G2939BA Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific VWR 89133-910
Bacto peptone BD Biosciences 211677
Benchling primer design tool Benchling https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine Fisher Scientific AAJ77507AB
Calcofluor white stain Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
Candida Genome Database http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads Polysciences  86057-3
Conda software https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit Epicypher 14-1048 Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) New England Biolabs N0447S
Dextrose (D-glucose) Fisher Scientific D163
Difco D-mannitol  BD Biosciences 217020
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x) Fisher Scientific R0611
DreamTaq green DNA polymerase Fisher Scientific EP0713 Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer Fisher Scientific EP0713 Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA Epicypher 18-1401
ELMI Microplate incubator ELMI TRMS-04 Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof VWR 89125-170
FastDigest MssI Fisher Scientific FD1344 Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer Fisher Scientific FD1344 Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400 Fisher BioReagents BP525-25
Fluorescence microscope User-dependent
Gel electrophoresis apparatus User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder Fisher Scientific FERSM1192
GitBash workflow https://gitforwindows.org/
GitHub source code https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5 Boston BioProducts BBH-75-K
High-speed centrifuge User-dependent
Isopropanol Sigma-Aldrich PX1830-4
Lens paper VWR 52846-001
Ligation Enhancer Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate MP Biomedicals 215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody Takara 632592 User-dependent
MACS2 https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes Epicypher 10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes Fisher Scientific MR02
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer BioTek EPOCH2TC Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS Sigma-Aldrich M3183
NaCl VWR 470302-522
NaOH Fisher Scientific S318-500
NCBI GEO https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) New England Biolabs E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit New England Biolabs E7645S Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT) Goldbio N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well Fisher Scientific EC62755BOX
Nutating mixer VWR 82007-202
Nutrient broth Criterion C6471
pADH110 Addgene 90982 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119 Addgene 90985 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137 Addgene 90986 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139 Addgene 90987 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140 Addgene 90988 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase Epicypher 15-1016 or 15-1116 50 rxn or 250 rxn
pCE1 Addgene 174434 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid Fisher Scientific FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase Fisher Scientific F530S Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350 VWR 10791-816
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit Invitrogen Q33230
Qubit fluorometer Life Technologies Q33216 Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody Epicypher 13-0042
RNase A Sigma-Aldrich 10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets Sigma-Aldrich 5056489001
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
Shaking incubator Eppendorf M12820004 User-dependent
Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters Fisher Scientific 07-200-385
Sterile inoculating loops VWR 30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain Fisher Scientific S11494
SYTO 13 nucleic acid stain Fisher Scientific S7575 Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler User-dependent
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Sigma-Aldrich 252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution Invitrogen 15632011
USER Enzyme Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer VWR 10153-834
wget tool http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Yeast extract Criterion C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) Fisher Scientific NC0439194

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
  3. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
  4. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
  5. Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
  6. Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
  7. Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
  8. Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
  9. Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
  10. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
  11. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
  12. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  13. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
  14. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  15. Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
  16. Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
  17. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
  18. Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  21. Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
  22. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  23. Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
  24. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  25. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  26. Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
  27. Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
  28. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).

Tags

Biologie Candida albicans CUT&RUN transcriptiefactoren genoombrede bindingsmethoden transcriptionele regulatie
Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij <em>Candida albicans</em>: een uitgebreide CUT &amp; RUN-methode en data-analyseworkflow
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qasim, M. N., Valle Arevalo, A.,… More

Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Paropkari, A. D., Ennis, C. L., Sindi, S. S., Nobile, C. J., Hernday, A. D. Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (182), e63655, doi:10.3791/63655 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter