Microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces
Summary
Un protocole est décrit qui utilise la microdissection laser pour isoler des tissus de nématodes individuels pour le séquençage de l’ARN. Le protocole ne nécessite pas de boîtes à outils génétiques spécifiques à l’espèce, ce qui permet de comparer les profils d’expression génique entre différentes espèces au niveau d’échantillons de tissus uniques.
Abstract
Les méthodologies unicellulaires ont révolutionné l’analyse des transcriptomes de types cellulaires spécifiques. Cependant, ils nécessitent souvent des « boîtes à outils » génétiques spécifiques à l’espèce, telles que des promoteurs conduisant à l’expression tissulaire spécifique des protéines fluorescentes. De plus, les protocoles qui perturbent les tissus pour isoler les cellules individuelles éliminent les cellules de leur environnement natif (par exemple, la signalisation des voisins) et peuvent entraîner des réponses au stress ou d’autres différences par rapport aux états d’expression des gènes natifs. Dans le présent protocole, la microdissection laser (LMD) est optimisée pour isoler les extrémités individuelles de la queue des nématodes pour l’étude de l’expression génique au cours de la morphogenèse de la pointe de la queue mâle.
LMD permet l’isolement d’une partie de l’animal sans avoir besoin de perturbation cellulaire ou de boîtes à outils spécifiques à l’espèce et est donc applicable à toutes les espèces. Par la suite, des protocoles de préparation de bibliothèque d’ARN-seq unicellulaires tels que CEL-Seq2 peuvent être appliqués à des tissus uniques isolés de LMD et analysés à l’aide de pipelines standard, étant donné qu’un génome ou un transcriptome bien annoté est disponible pour l’espèce. Ces données peuvent être utilisées pour établir dans quelle mesure les transcriptomes sont conservés ou différents qui sous-tendent le développement de ce tissu chez différentes espèces.
Les limites comprennent la capacité de découper le tissu d’intérêt et la taille de l’échantillon. Une analyse de puissance montre qu’aussi peu que 70 embouts de queue par condition sont nécessaires pour une puissance de 80%. Une synchronisation étroite du développement est nécessaire pour obtenir ce nombre d’animaux au même stade de développement. Ainsi, une méthode de synchronisation des animaux à des intervalles de 1 heure est également décrite.
Introduction
Les nématodes, en particulier les nématodes rhabditidés liés au système modèle Caenorhabditis elegans, constituent un merveilleux groupe d’animaux pour la biologie évolutive du développement (EDB) pour de nombreuses raisons 1,2. Les avantages comprennent leur petit nombre de cellules, leurs lignées cellulaires définies et cohérentes, leur transparence et leur facilité de culture et d’élevage. Il existe également de nombreuses ressources disponibles, y compris des génomes de haute qualité pour plusieurs espèces, et pour C. elegans, des outils de génétique moléculaire étendus et des connaissances sur le développement, la génétique, l’anatomie et la physiologie 3,4,5,6.
Comme pour beaucoup d’autres organismes, la capacité de caractériser la dynamique du transcriptome dans des tissus uniques ou des cellules individuelles a révolutionné l’analyse du développement chez C. elegans 7,8,9,10. Être capable de comparer des transcriptomes unicellulaires à travers des nématodes transformerait de la même manière l’EDB en utilisant ces organismes. Par exemple, de telles comparaisons permettraient de mieux comprendre comment les réseaux de régulation des gènes ont évolué pour les caractères (traits) qui ont été conservés, pour les caractères qui ont divergé ou pour les caractères qui ont évolué indépendamment.
Cependant, isoler des tissus ou des cellules particuliers des nématodes est l’un des grands défis. Pour de nombreux organismes, les cellules individuelles peuvent être dissociées des tissus et récoltées de manière impartiale ou peuvent être marquées avec l’expression tissulaire spécifique d’une protéine fluorescente et triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)11. Chez C. elegans, l’isolement cellulaire à haut débit (HTP) a été limité principalement aux embryons parce que la cuticule externe dure (et le squelette hydrostatique) a entravé l’isolement cellulaire des larves et des adultes. Pour contourner ce défi, certaines méthodes ont utilisé des outils génétiques chez des vers C. elegans entiers, tels que le marquage de l’ARNm12 spécifique aux tissus et les comparaisons d’expression différentielle entre le type sauvage et les mutants affectant un type cellulaire13. Des méthodes plus récentes ont surmonté le défi en dissolvant la cuticule pour isoler les noyaux14 ou des cellules entières 8,9,15. L’isolement cellulaire et la culture cellulaire présentent toutefois des inconvénients évidents : les cellules sont retirées de leur contexte naturel de développement ou anatomique – par exemple, loin de la signalisation cellule-cellule et du contact avec la matrice extracellulaire – ce qui devrait avoir un impact sur le profil d’expression génique15. De plus, les outils génétiques et les marqueurs spécifiques aux tissus sont spécifiques à l’espèce (c’est-à-dire qu’ils ne peuvent être utilisés que chez C. elegans).
LMD fournit une méthode alternative pour isoler les tissus sans perturber le contexte naturel des cellules. De manière significative pour l’EDB, la LMD permet également de comparer les transcriptomes de tissus homologues de différentes espèces sans avoir besoin de boîtes à outils génétiques spécifiques à l’espèce si des séquences de génome ou de transcriptome entier de ces espèces sont disponibles. La LMD consiste à cibler les tissus par observation microscopique directe et à utiliser un microfaisceau laser – intégré à l’optique du microscope – pour découper et récolter (capturer) le tissu d’intérêt16. Les limites de la LMD sont qu’elle n’est pas propice aux approches très HTP (bien que les profils de transcription pour les pointes de queue, tels que décrits dans ce protocole, étaient robustes avec environ 70 échantillons), certains échantillons peuvent être difficiles à disséquer et les coupes sont limitées à la précision du laser et à ce qui peut être visualisé au microscope.
Le but du présent protocole est de décrire comment la LMD, suivie de l’ARN-Seq à tissu unique, peut être utilisée pour obtenir des données sur le transcriptome spécifiques au stade et aux tissus à partir de nématodes. Plus précisément, il démontre que la LMD isole les extrémités de la queue des larves du quatrième stade (L4) de C. elegans. Cependant, cette méthode peut être adaptée à d’autres tissus et, bien sûr, à différentes espèces.
Chez C. elegans, il y a 4 cellules qui font le bout de la queue chez les mâles et les hermaphrodites. Au cours du stade L4 chez les mâles, mais pas chez les hermaphrodites, les cellules de la pointe de la queue changent de forme et migrent vers l’avant et vers l’intérieur. Ce processus se produit également chez certaines espèces de nématodes rhabditidés, mais pas chez toutes. Par conséquent, l’extrémité de la queue est un bon modèle pour l’évolution de la morphogenèse dimorphique sexuelle. En raison de sa position, l’extrémité de la queue est également facile à isoler par LMD.
Pour obtenir des profils de transcriptome à partir des extrémités de la queue, le présent protocole utilise CEL-Seq2, une méthode ARN-seq développée pour les cellules individuelles17,18. Cette méthode présente plusieurs avantages pour les tissus dérivés de la LMD. CEL-Seq2 est très sensible et efficace, utilisant des identificateurs moléculaires uniques (UMI) pour permettre une quantification simple des lectures d’ARNm, une transcription in vitro pour assurer une amplification linéaire et un codage à barres qui permet le multiplexage d’échantillons de tissus individuels. La seule limite de CEL-Seq2 est que les lectures récupérées sont biaisées à l’extrémité 3′ des ARNm, et la plupart des isoformes ne peuvent donc pas être distinguées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques de la méthode
Si elle est effectuée correctement, la méthode décrite ici permettra d’obtenir des profils d’ARN robustes avec un nombre relativement faible d’échantillons disséqués au laser (70 pointes de queue dans cet exemple). Cependant, pour les échantillons provenant d’animaux en développement, une synchronisation étroite est essentielle pour réduire la variabilité entre les échantillons. Pour cette raison, le protocole recommande la méthode hatch-off pour l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les subventions des NIH (R01GM141395) et de la NSF (1656736) à DF et des bourses NIH (F32GM136170) à AW. La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender.com.
Materials
| 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free | Leica | 11600288 | for LMD |
| 500 µL PCR tubes (nuclease-free) | Axygen | 732-0675 | to cut the tail tips into |
| Compound microscope with 40x objective and DIC | any | to check age of worms | |
| Desktop humidifier | any | ||
| Dissection microscope with transmitted light base | any | for all worm work | |
| glass pasteur pipets | any | handle of worm pick | |
| glass slides and coverslips | any | to check age of worms | |
| LMD6 microdissection system | Leica | multiple | to cut tail tips |
| LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf | 22431005 | |
| M9 Buffer | Recipe in WormBook | ||
| Methanol 99.8% | Sigma | 322415 | to fix worms |
| NGM growth medium | US Biological | N1000 | Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook |
| P10 pipette variablle volume | e.g. Gilson | ||
| P1000 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| P2 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| Pipette tips 1,000 µL | any | ||
| Pipette tips 1-10 µL filtered | any | ||
| platinum iridium wire | Tritech | PT-9010 | to make worm pick |
| sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes | any | ||
| Tween 20 | Sigma | P9416 | Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips |
| vented 6 mm plastic Petri dishes | any | ||
| For CEL-Seq2 | |||
| 4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection | Aligent | automated electrophoresis system | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA cleanup beads |
| Bead binding buffer 20% PEG8000, 2.5 M NaCl | |||
| CEL-Seq2 primers (see Table S1) | Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf | 6335000020 | Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes. |
| DNA Polymerase I (E. coli) | Invitrogen | 18052-025 | |
| dNTP mix 10 mM | any | ||
| E. coli DNA ligase | Invitrogen | 18052-019 | |
| Ethanol | |||
| ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up | Affymetrix | 78200 | exonuclease solution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | For step 4.6.1 |
| Nuclease-free water | any | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531 | PCR mix step 4.9.7 |
| random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN |
IDT | a primer with 6 nucleotides that are random | |
| RNA Fragmentation buffer | NEB | E6150S | |
| RNA Fragmentation stop buffer | NEB | E6150S | |
| RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) | Illumina, NEB, or IDT | RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina | |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Scientific | 7000TS1 | or any other similar product |
| RNaseH (E. coli) | Invitrogen | 18021-071 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | |
| Second strand buffer | Invitrogen | 10812-014 | |
| Superscripit II | Invitrogen | 18064-014 | reverse transcriptase |
References
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