Microdissezione laser per applicazioni a tessuto singolo indipendenti dalla specie
Summary
Viene descritto un protocollo che utilizza la microdissezione laser per isolare i singoli tessuti nematodi per il sequenziamento dell’RNA. Il protocollo non richiede toolkit genetici specie-specifici, consentendo di confrontare i profili di espressione genica tra diverse specie a livello di campioni di tessuto singolo.
Abstract
Le metodologie a singola cellula hanno rivoluzionato l’analisi dei trascrittomi di specifici tipi cellulari. Tuttavia, spesso richiedono “toolkit” genetici specie-specifici, come i promotori che guidano l’espressione tessuto-specifica di proteine fluorescenti. Inoltre, i protocolli che interrompono i tessuti per isolare le singole cellule rimuovono le cellule dal loro ambiente nativo (ad esempio, la segnalazione dai vicini) e possono causare risposte allo stress o altre differenze dagli stati di espressione genica nativa. Nel presente protocollo, la microdissezione laser (LMD) è ottimizzata per isolare le singole punte della coda dei nematodi per lo studio dell’espressione genica durante la morfogenesi della punta della coda maschile.
LMD consente l’isolamento di una parte dell’animale senza la necessità di interruzioni cellulari o toolkit specifici per specie ed è quindi applicabile a qualsiasi specie. Successivamente, i protocolli di preparazione della libreria RNA-seq a singola cellula come CEL-Seq2 possono essere applicati a singoli tessuti isolati da LMD e analizzati utilizzando pipeline standard, dato che per la specie è disponibile un genoma o trascrittoma ben annotato. Tali dati possono essere utilizzati per stabilire quanto siano conservati o diversi i trascrittomi che sono alla base dello sviluppo di quel tessuto in specie diverse.
Le limitazioni includono la possibilità di tagliare il tessuto di interesse e la dimensione del campione. Un’analisi di potenza mostra che sono necessarie solo 70 punte di coda per condizione per l’80% di potenza. È necessaria una stretta sincronizzazione dello sviluppo per ottenere questo numero di animali nella stessa fase di sviluppo. Pertanto, viene descritto anche un metodo per sincronizzare gli animali a intervalli di 1 ora.
Introduction
I nematodi, in particolare i nematodi rabditidi correlati al sistema modello Caenorhabditis elegans, sono un meraviglioso gruppo di animali per la biologia evolutiva dello sviluppo (EDB) per molte ragioni 1,2. I vantaggi includono il loro piccolo numero di cellule, lignaggi cellulari definiti e coerenti, la trasparenza e la facilità di coltura e allevamento. Ci sono anche molte risorse disponibili, tra cui genomi di alta qualità per più specie e per C. elegans, ampi strumenti genetici molecolari e conoscenze sullo sviluppo, la genetica, l’anatomia e la fisiologia 3,4,5,6.
Come per molti altri organismi, la capacità di caratterizzare la dinamica del trascrittoma in singoli tessuti o singole cellule ha rivoluzionato l’analisi dello sviluppo in C. elegans 7,8,9,10. Essere in grado di confrontare i trascrittomi unicellulari tra i nematodi trasformerebbe allo stesso modo l’EDB usando questi organismi. Ad esempio, tali confronti fornirebbero informazioni su come le reti di regolazione genica si sono evolute per i caratteri (tratti) che sono stati conservati, per i caratteri che si sono divergenti o per i caratteri che si sono evoluti in modo indipendente.
Tuttavia, isolare particolari tessuti o cellule dai nematodi è una delle grandi sfide. Per molti organismi, le singole cellule possono essere dissociate dai tessuti e raccolte in modo imparziale o possono essere etichettate con l’espressione tessuto-specifica di una proteina fluorescente e ordinate mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)11. In C. elegans, l’isolamento ad alto rendimento (HTP) delle cellule è stato limitato principalmente agli embrioni perché la cuticola esterna dura (e lo scheletro idrostatico) ha ostacolato l’isolamento cellulare da larve e adulti. Per aggirare questa sfida, alcuni metodi hanno impiegato strumenti genetici in interi vermi C. elegans, come l’mRNA12 specifico del tessuto e i confronti di espressione differenziale tra wild-type e mutanti che colpiscono un tipo di cellula13. Metodi più recenti hanno superato la sfida sciogliendo la cuticola per isolare nuclei14 o intere cellule 8,9,15. L’isolamento cellulare e la coltura cellulare hanno gli ovvi svantaggi, tuttavia, che le cellule vengono rimosse dal loro naturale contesto di sviluppo o anatomico , ad esempio lontano dalla segnalazione cellula-cellula e dal contatto con la matrice extracellulare – che dovrebbero avere un impatto sul profilo di espressione genica15. Inoltre, gli strumenti genetici e i marcatori tessuto-specifici sono specie-specifici (cioè, possono essere utilizzati solo in C. elegans).
LMD fornisce un metodo alternativo per isolare i tessuti senza interrompere il contesto naturale delle cellule. Significativamente per l’EDB, LMD consente anche di confrontare i trascrittomi di tessuti omologhi di diverse specie senza la necessità di toolkit genetici specie-specifici se sono disponibili sequenze di genoma o intere sequenze di trascrittomi di queste specie. LMD prevede il targeting dei tessuti mediante osservazione microscopica diretta e l’utilizzo di un microfascio laser, integrato nell’ottica del microscopio, per ritagliare e raccogliere (catturare) il tessuto di interesse16. I limiti di LMD sono che non è favorevole ad approcci molto HTP (anche se i profili di trascrizione per le punte di coda, come descritto in questo protocollo, erano robusti con ~ 70 campioni), alcuni campioni potrebbero essere difficili da sezionare e i tagli sono limitati alla precisione del laser e a ciò che può essere visualizzato al microscopio.
Lo scopo del presente protocollo è quello di descrivere come LMD, seguito da RNA-Seq a tessuto singolo, può essere utilizzato per ottenere dati sul trascrittoma specifico dello stadio e del tessuto dai nematodi. In particolare, dimostra LMD per isolare le punte della coda dalle larve del quarto stadio (L4) di C. elegans. Tuttavia, questo metodo può essere adattato ad altri tessuti e, naturalmente, a specie diverse.
In C. elegans, ci sono 4 cellule che fanno la punta della coda sia nei maschi che negli ermafroditi. Durante lo stadio L4 nei maschi, ma non negli ermafroditi, le cellule della punta della coda cambiano forma e migrano anteriormente e verso l’interno. Questo processo si verifica anche in alcune ma non in tutte le altre specie di nematodi rabditidi. Pertanto, la punta della coda è un buon modello per l’evoluzione della morfogenesi dimorfica sessuale. A causa della sua posizione, la punta della coda è anche facile da isolare da LMD.
Per ottenere profili di trascrittoma dalle punte della coda, il presente protocollo utilizza CEL-Seq2, un metodo RNA-seq sviluppato per singole cellule17,18. Questo metodo ha diversi vantaggi per i tessuti derivati da LMD. CEL-Seq2 è altamente sensibile ed efficiente, utilizzando identificatori molecolari univoci (UMI) per consentire una quantificazione diretta delle letture dell’mRNA, la trascrizione in vitro per garantire l’amplificazione lineare e il codice a barre che consente il multiplexing di singoli campioni di tessuto. L’unica limitazione di CEL-Seq2 è che le letture recuperate sono distorte verso l’estremità 3′ degli mRNA, e la maggior parte delle isoforme quindi non può essere distinta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici del metodo
Se eseguito correttamente, il metodo qui descritto otterrà profili di RNA robusti con un numero relativamente piccolo di campioni sezionati al laser (70 punte di coda in questo esempio). Tuttavia, per i campioni provenienti da animali in via di sviluppo, una stretta sincronizzazione è fondamentale per ridurre la variabilità tra i campioni. Per questo motivo, il protocollo consiglia il metodo hatch-off per la sincronizzazione worm. Qui, il ricercatore può determinare e c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da NIH (R01GM141395) e NSF (1656736) sovvenzioni a DF e NIH fellowship (F32GM136170) ad AW. La Figura 1 è stata creata con l’aiuto di BioRender.com.
Materials
| 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free | Leica | 11600288 | for LMD |
| 500 µL PCR tubes (nuclease-free) | Axygen | 732-0675 | to cut the tail tips into |
| Compound microscope with 40x objective and DIC | any | to check age of worms | |
| Desktop humidifier | any | ||
| Dissection microscope with transmitted light base | any | for all worm work | |
| glass pasteur pipets | any | handle of worm pick | |
| glass slides and coverslips | any | to check age of worms | |
| LMD6 microdissection system | Leica | multiple | to cut tail tips |
| LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf | 22431005 | |
| M9 Buffer | Recipe in WormBook | ||
| Methanol 99.8% | Sigma | 322415 | to fix worms |
| NGM growth medium | US Biological | N1000 | Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook |
| P10 pipette variablle volume | e.g. Gilson | ||
| P1000 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| P2 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| Pipette tips 1,000 µL | any | ||
| Pipette tips 1-10 µL filtered | any | ||
| platinum iridium wire | Tritech | PT-9010 | to make worm pick |
| sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes | any | ||
| Tween 20 | Sigma | P9416 | Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips |
| vented 6 mm plastic Petri dishes | any | ||
| For CEL-Seq2 | |||
| 4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection | Aligent | automated electrophoresis system | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA cleanup beads |
| Bead binding buffer 20% PEG8000, 2.5 M NaCl | |||
| CEL-Seq2 primers (see Table S1) | Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf | 6335000020 | Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes. |
| DNA Polymerase I (E. coli) | Invitrogen | 18052-025 | |
| dNTP mix 10 mM | any | ||
| E. coli DNA ligase | Invitrogen | 18052-019 | |
| Ethanol | |||
| ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up | Affymetrix | 78200 | exonuclease solution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | For step 4.6.1 |
| Nuclease-free water | any | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531 | PCR mix step 4.9.7 |
| random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN |
IDT | a primer with 6 nucleotides that are random | |
| RNA Fragmentation buffer | NEB | E6150S | |
| RNA Fragmentation stop buffer | NEB | E6150S | |
| RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) | Illumina, NEB, or IDT | RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina | |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Scientific | 7000TS1 | or any other similar product |
| RNaseH (E. coli) | Invitrogen | 18021-071 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | |
| Second strand buffer | Invitrogen | 10812-014 | |
| Superscripit II | Invitrogen | 18064-014 | reverse transcriptase |
References
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