Microdisección láser para aplicaciones de un solo tejido independientes de la especie
Summary
Se describe un protocolo que utiliza la microdisección láser para aislar tejidos de nematodos individuales para la secuenciación de ARN. El protocolo no requiere kits de herramientas genéticas específicas de la especie, lo que permite comparar los perfiles de expresión génica entre diferentes especies a nivel de muestras de un solo tejido.
Abstract
Las metodologías unicelulares han revolucionado el análisis de los transcriptomas de tipos celulares específicos. Sin embargo, a menudo requieren “kits de herramientas” genéticos específicos de la especie, como promotores que impulsan la expresión específica de proteínas fluorescentes en los tejidos. Además, los protocolos que interrumpen los tejidos para aislar células individuales eliminan las células de su entorno nativo (por ejemplo, la señalización de los vecinos) y pueden provocar respuestas al estrés u otras diferencias con los estados de expresión génica nativa. En el presente protocolo, la microdisección láser (LMD) está optimizada para aislar las puntas individuales de la cola de los nematodos para el estudio de la expresión génica durante la morfogénesis de la punta de la cola masculina.
LMD permite el aislamiento de una porción del animal sin la necesidad de interrupción celular o kits de herramientas específicos de la especie y, por lo tanto, es aplicable a cualquier especie. Posteriormente, los protocolos de preparación de la biblioteca de ARN-seq de una sola célula, como CEL-Seq2, se pueden aplicar a tejidos individuales aislados de LMD y analizarse utilizando tuberías estándar, dado que se dispone de un genoma o transcriptoma bien anotado para la especie. Dichos datos se pueden utilizar para establecer qué tan conservados o diferentes son los transcriptomas que subyacen al desarrollo de ese tejido en diferentes especies.
Las limitaciones incluyen la capacidad de cortar el tejido de interés y el tamaño de la muestra. Un análisis de potencia muestra que se requieren tan solo 70 puntas de cola por condición para obtener un 80% de potencia. Se necesita una estrecha sincronización del desarrollo para obtener este número de animales en la misma etapa de desarrollo. Por lo tanto, también se describe un método para sincronizar animales a intervalos de 1 h.
Introduction
Los nematodos, particularmente los nematodos rabdíidos relacionados con el sistema modelo Caenorhabditis elegans, son un maravilloso grupo de animales para la biología evolutiva del desarrollo (EDB) por muchas razones 1,2. Las ventajas incluyen su pequeño número de células, linajes celulares definidos y consistentes, transparencia y facilidad de cultivo y cría. También hay muchos recursos disponibles, incluidos genomas de alta calidad para múltiples especies, y para C. elegans, amplias herramientas genéticas moleculares y conocimientos sobre desarrollo, genética, anatomía y fisiología 3,4,5,6.
Al igual que con muchos otros organismos, la capacidad de caracterizar la dinámica del transcriptoma en tejidos individuales o células individuales ha revolucionado el análisis del desarrollo en C. elegans 7,8,9,10. Ser capaz de comparar transcriptomas unicelulares entre nematodos transformaría de manera similar EDB utilizando estos organismos. Por ejemplo, tales comparaciones proporcionarían información sobre cómo las redes reguladoras de genes han evolucionado para los caracteres (rasgos) que se han conservado, para los caracteres que han divergido o para los caracteres que evolucionaron de forma independiente.
Sin embargo, aislar tejidos o células particulares de los nematodos es uno de los grandes desafíos. Para muchos organismos, las células individuales pueden disociarse de los tejidos y cosecharse de manera imparcial o pueden etiquetarse con la expresión específica del tejido de una proteína fluorescente y clasificarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)11. En C. elegans, el aislamiento de células de alto rendimiento (HTP) se ha limitado principalmente a embriones porque la cutícula externa dura (y el esqueleto hidrostático) ha obstaculizado el aislamiento celular de larvas y adultos. Para sortear este desafío, algunos métodos han empleado herramientas genéticas en gusanos C. elegans completos, como el etiquetado de ARNm específico del tejido12 y las comparaciones de expresión diferencial entre el tipo salvaje y los mutantes que afectan a un tipo celular13. Métodos más recientes han superado el desafío disolviendo la cutícula para aislar núcleos14 o células enteras 8,9,15. Sin embargo, el aislamiento celular y el cultivo celular tienen las desventajas obvias de que las células se eliminan de su contexto anatómico o de desarrollo natural, por ejemplo, lejos de la señalización célula-célula y el contacto con la matriz extracelular, que se espera que afecten el perfil de expresión génica15. Además, las herramientas genéticas y los marcadores específicos de tejidos son específicos de la especie (es decir, solo se pueden usar en C. elegans).
LMD proporciona un método alternativo para aislar tejidos sin interrumpir el contexto natural de las células. Significativamente para EDB, LMD también permite comparar transcriptomas de tejidos homólogos de diferentes especies sin la necesidad de kits de herramientas genéticas específicas de la especie si se dispone de secuencias del genoma o del transcriptoma completo de estas especies. LmD consiste en dirigirse a los tejidos mediante la observación microscópica directa y el uso de una microhaz láser, integrada en la óptica del microscopio, para cortar y cosechar (capturar) el tejido de interés16. Las limitaciones de LMD son que no es propicio para enfoques muy HTP (aunque los perfiles de transcripción para las puntas de la cola, como se describe en este protocolo, eran robustos con ~ 70 muestras), ciertas muestras pueden ser difíciles de diseccionar, y los cortes se limitan a la precisión del láser y lo que se puede visualizar en el microscopio.
El propósito del presente protocolo es describir cómo lmD, seguido de ARN-Seq de un solo tejido, se puede utilizar para obtener datos de transcriptoma específicos de estadios y tejidos de nematodos. Específicamente, demuestra LMD para aislar las puntas de la cola de larvas de cuarta etapa (L4) de C. elegans. Sin embargo, este método se puede adaptar a otros tejidos y, por supuesto, a diferentes especies.
En C. elegans, hay 4 células que hacen la punta de la cola tanto en machos como en hermafroditas. Durante la etapa L4 en los machos, pero no en los hermafroditas, las células de la punta de la cola cambian su forma y migran hacia arriba y hacia adentro. Este proceso también ocurre en algunas pero no en todas las demás especies de nematodos rabdítidos. Por lo tanto, la punta de la cola es un buen modelo para la evolución de la morfogénesis dimórfica sexual. Debido a su posición, la punta de la cola también es fácil de aislar por LMD.
Para obtener perfiles de transcriptoma a partir de puntas de cola, el presente protocolo utiliza CEL-Seq2, un método de ARN-seq desarrollado para células individuales17,18. Este método tiene varias ventajas para los tejidos derivados de LMD. CEL-Seq2 es altamente sensible y eficiente, utilizando identificadores moleculares únicos (UMI) para permitir la cuantificación directa de las lecturas de ARNm, la transcripción in vitro para garantizar la amplificación lineal y el código de barras que permite la multiplexación de muestras de tejido individuales. La única limitación de CEL-Seq2 es que las lecturas recuperadas están sesgadas al extremo 3′ de los ARNm, y la mayoría de las isoformas no se pueden distinguir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos del método
Si se realiza correctamente, el método descrito aquí obtendrá perfiles de ARN robustos con un número relativamente pequeño de muestras diseccionadas con láser (70 puntas de cola en este ejemplo). Sin embargo, para las muestras de animales en desarrollo, la sincronización estrecha es fundamental para reducir la variabilidad entre las muestras. Por esta razón, el protocolo recomienda el método de sombreado para la sincronización de gusanos. Aquí, el investigador pu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por las subvenciones NIH (R01GM141395) y NSF (1656736) a DF y nih fellowship (F32GM136170) a AW. La Figura 1 fue creada con la ayuda de BioRender.com.
Materials
| 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free | Leica | 11600288 | for LMD |
| 500 µL PCR tubes (nuclease-free) | Axygen | 732-0675 | to cut the tail tips into |
| Compound microscope with 40x objective and DIC | any | to check age of worms | |
| Desktop humidifier | any | ||
| Dissection microscope with transmitted light base | any | for all worm work | |
| glass pasteur pipets | any | handle of worm pick | |
| glass slides and coverslips | any | to check age of worms | |
| LMD6 microdissection system | Leica | multiple | to cut tail tips |
| LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf | 22431005 | |
| M9 Buffer | Recipe in WormBook | ||
| Methanol 99.8% | Sigma | 322415 | to fix worms |
| NGM growth medium | US Biological | N1000 | Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook |
| P10 pipette variablle volume | e.g. Gilson | ||
| P1000 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| P2 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| Pipette tips 1,000 µL | any | ||
| Pipette tips 1-10 µL filtered | any | ||
| platinum iridium wire | Tritech | PT-9010 | to make worm pick |
| sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes | any | ||
| Tween 20 | Sigma | P9416 | Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips |
| vented 6 mm plastic Petri dishes | any | ||
| For CEL-Seq2 | |||
| 4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection | Aligent | automated electrophoresis system | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA cleanup beads |
| Bead binding buffer 20% PEG8000, 2.5 M NaCl | |||
| CEL-Seq2 primers (see Table S1) | Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf | 6335000020 | Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes. |
| DNA Polymerase I (E. coli) | Invitrogen | 18052-025 | |
| dNTP mix 10 mM | any | ||
| E. coli DNA ligase | Invitrogen | 18052-019 | |
| Ethanol | |||
| ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up | Affymetrix | 78200 | exonuclease solution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | For step 4.6.1 |
| Nuclease-free water | any | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531 | PCR mix step 4.9.7 |
| random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN |
IDT | a primer with 6 nucleotides that are random | |
| RNA Fragmentation buffer | NEB | E6150S | |
| RNA Fragmentation stop buffer | NEB | E6150S | |
| RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) | Illumina, NEB, or IDT | RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina | |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Scientific | 7000TS1 | or any other similar product |
| RNaseH (E. coli) | Invitrogen | 18021-071 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | |
| Second strand buffer | Invitrogen | 10812-014 | |
| Superscripit II | Invitrogen | 18064-014 | reverse transcriptase |
References
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