ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.
Abstract
כבעל חוליות, דג הזברה נמצא בשימוש נרחב במחקרים ביולוגיים. דגי זברה ובני אדם חולקים הומולוגיה גנטית גבוהה, המאפשרת את השימוש בה כמודל למחלות אנושיות. מחקר תפקוד גנים מבוסס על זיהוי דפוסי ביטוי גנים. למרות שאימונוהיסטוכימיה מציעה דרך רבת עוצמה להעריך ביטוי חלבונים, המספר המוגבל של נוגדנים זמינים מסחרית בדגי זברה מגביל את היישום של costaining. הכלאה באתרו נמצאת בשימוש נרחב בעוברים של דגי זברה כדי לזהות ביטוי mRNA. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה עבור קטעי עוברים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. אימונוהיסטוכימיה והדמיה של קריוסקציה יחידה בוצעו לאחר הכלאה באתר . הפרוטוקול עוזר לפענח את דפוס הביטוי של שני גנים, תחילה על ידי זיהוי תעתיק באתרו ולאחר מכן על ידי אימונוהיסטוכימיה כנגד חלבון באותו קטע.
Introduction
דג הזברה הוא מודל רב עוצמה של בעלי חוליות לחקר התפתחות וגנטיקה 1,2. דגי זברה ובני אדם חולקים הומולוגיה גנטית גבוהה (70% מהגנים משותפים עם הגנום האנושי), המאפשרת את השימוש בה כמודל למחלות אנושיות3. בדגי זברה שכיח למדי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים ואת הקשר המרחבי ביניהם. אימונוהיסטוכימיה שימשה לראשונה בשנת 1941 לזיהוי פתוגנים ברקמות נגועות על ידי יישום נוגדנים המסומנים בתווית FITC4. חלבון המטרה באזור הרקמה מסומן תחילה בנוגדן ראשוני, ולאחר מכן החלק מסומן בנוגדן משני כנגד המין המארח של הנוגדן הראשוני, אימונוגלובולין. צביעת נוגדנים היא גישה חזקה לזיהוי לוקליזציה של חלבונים, המציעה רזולוציה אופטית גבוהה ברמה התוך תאית. עם זאת, מספר הנוגדנים הזמינים מוגבל מאוד בדגי זברה. מחקר שנערך לאחרונה מראה כי כ -112,000 נוגדנים זמינים באופן מסחרי עבור עכברים; עם זאת, מעט מאוד נוגדנים הוכחו כאמינים בדגי זברה5.
במקום זאת, בדגי זברה, הכלאה באתרה יושמה באופן נרחב לניתוח דפוסי ביטוי גנים. שיטה זו שימשה לראשונה להערכת ביטוי גנים בעוברי דרוזופילה בשנות ה-80 6,7, ומאז טכנולוגיה זו פותחה ושוכללה ללא הרף. בתחילה, בדיקות DNA מסומנות רדיו שימשו כדי לזהות תעתיקי mRNA; עם זאת, הרזולוציה המרחבית הייתה נמוכה יחסית, והיו סיכונים בריאותיים פוטנציאליים שנגרמו על ידי הרדיואקטיביות. לאחר מכן, הכלאה באתרה מסתמכת על בדיקות RNA המסומנות עם digoxigenin (DIG) או fluorescein (Fluo), אשר מצומדות לפוספטאז אלקליין (AP) או מזוהות על ידי הגברת אות טירמיד פלואורסצנטי (TSA)8,9. למרות שנעשה שימוש ב-TSA כדי לזהות שניים או שלושה גנים, תיוג DIG של בדיקות RNA ונוגדנים מצומדים של antiDIG AP הם עדיין גישות רגישות מאוד, יציבות ובשימוש נרחב להכלאה באתר. לכן, נוגדנים ממוסחרים בשילוב עם בדיקות באתרן המסומנות ב-DIG שימושיים למתן תובנה לגבי לוקליזציה של חלבונים וביטוי של גן אחד.
עוברים שלמים אינם יכולים לחשוף את הקשר המרחבי בין גנים בשל הרזולוציה האופטית הנמוכה, למרות שעוברים של דגי זברה קטנים ושקופים10. לפיכך, חתך יש צורך לנתח את דפוסי הביטוי של גנים ברמה התאית. Cryosectioning כבר בשימוש נרחב בדגי זברה כפי שהוא קל לבצע יכול ביעילות לשמר את האנטיגן. לכן, הכלאה באתרו בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בקריוסקציות של דגי זברה מציעה דרך רבת עוצמה לניתוח דפוסי הביטוי של שני גנים. שילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה יושם על דגי זברה11. עם זאת, טיפול בפרוטאינאז K שימש לשיפור חדירת הבדיקה על חשבון שלמות האנטיגן. כדי להתגבר על מגבלה זו, פרוטוקול זה משתמש בחימום כדי לגרום לשליפת אנטיגן. פרוטוקול זה חל לא רק על עוברים בשלבים שונים וחלקי רקמות בעוביים שונים (קטעי ראש של 14 מיקרומטר וחלקי חוט שדרה של 20 מיקרומטר), אלא הוא אומת גם באמצעות גנים המבוטאים בשני איברים, כולל הראש וחוט השדרה.
מאמר זה יתאר כיצד לשלב הכלאה באתרו וצביעת נוגדנים בעוברים של דגי זברה בהקפאה. הרבגוניות של פרוטוקול זה מודגמת על ידי שימוש במספר שילובים של הכלאה באתרו-אימונוהיסטוכימיה, כולל בדיקות הכלאה באתרן עבור שני נוירונים שונים. שיטה זו מתאימה לאיתור mRNA וחלבון באזורים שונים ובעוברים בגילאים שונים, וכן לדפוסי ביטוי של שני גנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציע שילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה, צעד חשוב בניסויי הקולוקליזציה בעוברים של דגי זברה. שיטה זו משמשת דרך קלה ויעילה לנתח בו זמנית mRNA אחד וחלבון אחד. הכלאה באתרו וצביעת נוגדנים בוצעו על עוברים של דגי זברה. בניגוד למספר פרוטוקולים שפורסמו בעבר14,15,16</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע והטכנולוגיה של נאנטונג של סין (MS12019011), קרן המדע והטכנולוגיה של נאנטונג של סין (JC2021058), והקרן למדעי הטבע של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג’יאנגסו (21KJB180009).
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
