Summary

На месте Гибридизация в сочетании с иммуногистохимией в криосекционированных эмбрионах рыбок данио-рерио

Published: March 03, 2022
doi:

Summary

В этом протоколе описывается, как получить изображения путем объединения гибридизации in situ и иммуногистохимии эмбриональных срезов рыбок данио. Гибридизация in situ проводилась перед криосекцией с последующим окрашиванием антителами. Полезно обнаружить паттерны экспрессии двух генов у рыбок данио, если антител не хватает.

Abstract

Как позвоночные, рыбки данио-рерио широко используются в биологических исследованиях. Рыбки данио-рерио и люди имеют высокую генетическую гомологию, что позволяет использовать его в качестве модели заболеваний человека. Исследование функции генов основано на обнаружении паттернов экспрессии генов. Хотя иммуногистохимия предлагает мощный способ анализа экспрессии белка, ограниченное количество коммерчески доступных антител у рыбок данио-рерио ограничивает применение окрашивания. Гибридизация in situ широко используется у эмбрионов рыбок данио-рерио для обнаружения экспрессии мРНК. В этом протоколе описывается, как получить изображения путем комбинирования гибридизации in situ и иммуногистохимии для срезов эмбрионов рыбок данио. Гибридизация in situ проводилась перед криосекцией с последующим окрашиванием антителами. Иммуногистохимия и визуализация одной криосекции были выполнены после гибридизации in situ . Протокол полезен для разгадки паттерна экспрессии двух генов, сначала путем обнаружения транскрипта in situ , а затем путем иммуногистохимии против белка в том же участке.

Introduction

Рыбки данио-рерио являются мощной моделью позвоночных для изучения развития и генетики 1,2. Рыбки данио-рерио и люди имеют высокую генетическую гомологию (70% генов являются общими с геномом человека), что позволяет использовать его в качестве модели для болезней человека3. У рыбок данио-рерио довольно часто обнаруживаются паттерны экспрессии двух генов и их пространственные отношения. Иммуногистохимия была впервые использована в 1941 году для обнаружения патогенов в инфицированных тканях путем применения антител, меченных FITC4. Белок-мишень в тканевом срезе сначала помечают первичным антителом, а затем срез помечают вторичным антителом против иммуноглобулина-хозяина первичного антитела. Окрашивание антител — это надежный подход к обнаружению локализации белков, который обеспечивает высокое оптическое разрешение на внутриклеточном уровне. Тем не менее, количество доступных антител очень ограничено у рыбок данио. Недавнее исследование показывает, что около 112 000 антител коммерчески доступны для мышей; Тем не менее, было продемонстрировано, что очень немногие антитела являются надежными у рыбокданио-рерио 5.

Вместо этого у рыбок данио-рерио гибридизация in situ широко применяется для анализа паттернов экспрессии генов. Этот метод был впервые использован для оценки экспрессии генов у эмбрионов дрозофилы в 1980-х годах6,7, и с тех пор эта технология постоянно развивалась и совершенствовалась. Первоначально для обнаружения транскриптов мРНК использовались ДНК-зонды с радиоактивной меткой; Однако пространственное разрешение было относительно низким, и существовали потенциальные риски для здоровья, вызванные радиоактивностью. Впоследствии гибридизация in situ опирается на РНК-зонды, меченные дигоксигенином (DIG) или флуоресцеином (Fluo), которые конъюгированы с щелочной фосфатазой (AP) или обнаруживаются с помощью флуоресцентного усиления тирамидного сигнала (TSA)8,9. Несмотря на то, что TSA используется для обнаружения двух или трех генов, маркировка DIG РНК-зондов и антиDIG-конъюгированные антитела AP по-прежнему являются высокочувствительными, стабильными и широко используемыми подходами для гибридизации in situ. Таким образом, коммерциализированные антитела в сочетании с DIG-меченными зондами in situ полезны для понимания локализации белка и экспрессии одного гена.

Цельные эмбрионы не могут выявить пространственную связь между генами из-за низкого оптического разрешения, даже несмотря на то, что эмбрионы рыбок данио-рерио маленькие и прозрачные10. Следовательно, секционирование необходимо для анализа паттернов экспрессии генов на внутриклеточном уровне. Криосекция широко используется у рыбок данио, поскольку она проста в выполнении и может эффективно сохранять антиген. Таким образом, гибридизация in situ в сочетании с иммуногистохимией в криосекциях рыбок данио-рерио предлагает мощный способ анализа паттернов экспрессии двух генов. Комбинация гибридизации in situ и иммуногистохимии была применена к рыбкам данио-рерио11. Однако лечение протеиназой К использовалось для усиления проникновения зонда за счет целостности антигена. Чтобы преодолеть это ограничение, этот протокол использует нагревание, чтобы вызвать извлечение антигена. Этот протокол применим не только к эмбрионам разных стадий и срезам тканей различной толщины (срезы головы 14 мкм и срезы спинного мозга 20 мкм), но также был проверен с использованием генов, экспрессируемых в двух органах, включая головной и спинной мозг.

В этой статье будет описано, как сочетать гибридизацию in situ и окрашивание антител у эмбрионов рыбок данио-рерио в криосекциях. Универсальность этого протокола демонстрируется с помощью ряда комбинаций гибридизации и иммуногистохимии in situ, включая зонды гибридизации in situ для двух разных нейронов. Этот метод подходит для обнаружения мРНК и белка в разных регионах и эмбрионах разного возраста, а также паттернов экспрессии двух генов.

Protocol

Все протоколы на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Наньтун (No S20191210-402). 1. Коллекция эмбрионов рыбок данио-рерио За ночь до сбора яиц поместите пару рыбок данио-рерио в аквариумы для раз?…

Representative Results

Этот протокол может быть использован для одновременного изучения паттерна экспрессии одной мРНК и одного белка. На рисунке 1 показан экспериментальный рабочий процесс. Рецептор 5-HT2C является подтипом рецептора 5-HT, связанного нейротрансмиттером серотонином (5-гидроксит…

Discussion

Этот протокол предлагает комбинацию гибридизации in situ и иммуногистохимии, что является важным шагом в экспериментах по колокализации эмбрионов рыбок данио. Этот метод служит простым и эффективным способом одновременного анализа одной мРНК и одного белка. Гибридизацию in situ и…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Китайским научно-техническим фондом Наньтун (MS12019011), Китайским научно-техническим фондом Наньтун (JC2021058) и Фондом естественных наук высших учебных заведений провинции Цзянсу (21KJB180009).

Materials

Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments Roche 11093274910
Anti-GFP antibody Millipore MAB3580
Blocking solution made in lab N/A 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple Roche 11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma B2064
CaCl2 Sigma C5670
Citrate buffer Leagene IH0305
Citric acid Sigma C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm Head Biotechnology H4566
DEPC-Treated Water Sangon Biotech B501005
Digital camera, fluorescence microscope Nikon NI-SSR 931479
E3 embryo medium made in lab N/A 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide Invitrogen AM9342
Goat serum Sigma G9023
Heparin sodium salt J&K Scientific 542858
HYB made in lab N/A preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box Mkbio MH10002
KCl Sigma P5405
Low profile leica blades Leica 819
MABT (1x) made in lab N/A 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid Sigma M0375
Methanol J&K Scientific 116481
Methylene blue Macklin M859248
MgSO4 Sigma M2643
NaCl Sigma S5886
NTMT made in lab N/A 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium Tissue-Tek 4583
PAP pen Enzo Life Sciences ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4% Abbexa abx082483 made in lab in 1x PBS
PBST (1x) made in lab N/A 1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea Merck 103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x) Invitrogen AM9624
preHYB made in lab N/A 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K Roche 1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt Sigma R3629
RNase-free 1.5 mL tubes Ambion AM12400
SSC (20x) Invitrogen AM9770
SSCT (0.2x) made in lab N/A 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x) made in lab N/A 1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose Invitrogen 15503022
Triton X-100 Sigma T9284
Tween-20 Sigma P1379
Zebrafish Laboratory Animal Center of Nantong University N/A

References

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
  3. Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  4. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  5. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
  6. Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
  7. Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
  8. Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
  9. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  10. Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
  11. Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
  12. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  13. Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
  14. Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
  15. Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
  16. Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
  17. O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).

Play Video

Cite This Article
Wang, J., Chai, R., Fang, X., Gu, J., Xu, W., Chen, Q., Chen, G., Zhu, S., Jin, Y. In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (181), e63715, doi:10.3791/63715 (2022).

View Video