في الموقع التهجين جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية في أجنة الزرد المبردة
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على الصور من خلال الجمع بين التهجين في الموقع والكيمياء المناعية للأقسام الجنينية لأسماك الزرد. تم إجراء التهجين في الموقع قبل التقسيم بالتبريد ، يليه تلطيخ الأجسام المضادة. من المفيد الكشف عن أنماط التعبير عن جينين في الزرد إذا كان هناك ندرة في الأجسام المضادة.
Abstract
كفقاريات ، تم استخدام الزرد على نطاق واسع في الدراسات البيولوجية. يشترك الزرد والبشر في التماثل الوراثي العالي ، والذي يسمح باستخدامه كنموذج للأمراض البشرية. تعتمد دراسة وظائف الجينات على الكشف عن أنماط التعبير الجيني. على الرغم من أن الكيمياء الهيستولوجية المناعية توفر طريقة قوية لفحص تعبير البروتين ، إلا أن العدد المحدود من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا في الزرد يقيد تطبيق التلطيخ. يستخدم التهجين في الموقع على نطاق واسع في أجنة الزرد للكشف عن تعبير mRNA. يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على الصور من خلال الجمع بين التهجين في الموقع والكيمياء المناعية لأقسام أجنة الزرد. تم إجراء التهجين في الموقع قبل التقسيم بالتبريد ، يليه تلطيخ الأجسام المضادة. تم إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية وتصوير تشريح واحد بعد التهجين في الموقع . البروتوكول مفيد لكشف نمط التعبير لجينين ، أولا عن طريق الكشف عن النسخ في الموقع ثم عن طريق الكيمياء الهيستولوجية المناعية ضد بروتين في نفس القسم.
Introduction
الزرد هو نموذج قوي للفقاريات لدراسات التنمية وعلم الوراثة1،2. يشترك الزرد والبشر في التماثل الجيني العالي (70٪ من الجينات مشتركة مع الجينوم البشري) ، مما يسمح باستخدامه كنموذج للأمراض البشرية3. في الزرد ، من الشائع جدا اكتشاف أنماط التعبير عن جينين وعلاقتهما المكانية. تم استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية لأول مرة في عام 1941 للكشف عن مسببات الأمراض في الأنسجة المصابة عن طريق تطبيق الأجسام المضادة التي تحمل علامة FITC4. يتم تمييز البروتين المستهدف في قسم الأنسجة أولا بجسم مضاد أولي ، ثم يتم تمييز القسم بجسم مضاد ثانوي ضد أنواع الغلوبولين المناعي المضيف للجسم المضاد الأساسي. تلطيخ الأجسام المضادة هو نهج قوي للكشف عن توطين البروتينات ، والذي يوفر دقة بصرية عالية على المستوى داخل الخلايا. ومع ذلك ، فإن عدد الأجسام المضادة المتاحة محدود للغاية في الزرد. أظهرت دراسة حديثة أن ما يقرب من 112000 جسم مضاد متاح تجاريا للفئران. ومع ذلك ، فقد ثبت أن عددا قليلا جدا من الأجسام المضادة يمكن الاعتماد عليها في الزرد5.
بدلا من ذلك ، في الزرد ، تم تطبيق التهجين في الموقع على نطاق واسع لتحليل نمط التعبير الجيني. تم استخدام هذه الطريقة لأول مرة لتقييم التعبير الجيني في أجنة ذبابة الفاكهة في ثمانينيات القرن العشرين 6,7 ، ومنذ ذلك الحين ، تم تطوير هذه التكنولوجيا وتحسينها باستمرار. في البداية ، تم استخدام مجسات الحمض النووي ذات العلامات الإشعاعية للكشف عن نسخ mRNA. ومع ذلك ، كانت الدقة المكانية منخفضة نسبيا ، وكانت هناك مخاطر صحية محتملة ناجمة عن النشاط الإشعاعي. بعد ذلك ، يعتمد التهجين في الموقع على مجسات الحمض النووي الريبي الموسومة بالديجوكسيجينين (DIG) أو الفلوريسئين (Fluo) ، والتي يتم اقترانها بالفوسفاتيز القلوي (AP) أو يتم اكتشافها بواسطة تضخيم إشارة التيراميد الفلوري (TSA) 8,9. على الرغم من استخدام TSA للكشف عن جينين أو ثلاثة جينات ، إلا أن وضع العلامات على DIG لتحقيقات الحمض النووي الريبي والأجسام المضادة المترافقة antiDIG AP لا تزال مناهج حساسة للغاية ومستقرة ومستخدمة على نطاق واسع للتهجين في الموقع. لذلك ، فإن الأجسام المضادة التجارية جنبا إلى جنب مع المجسات في الموقع التي تحمل علامة DIG مفيدة لتوفير نظرة ثاقبة حول توطين البروتين والتعبير عن جين واحد.
لا يمكن للأجنة الكاملة أن تكشف عن العلاقة المكانية بين الجينات بسبب الدقة البصرية المنخفضة ، على الرغم من أن أجنة الزرد صغيرة وشفافة10. وبالتالي ، فإن التقسيم ضروري لتحليل أنماط التعبير عن الجينات على المستوى داخل الخلايا. تم استخدام التشريح بالتبريد على نطاق واسع في الزرد لأنه سهل الأداء ويمكن أن يحافظ على المستضد بشكل فعال. لذلك ، يوفر التهجين في الموقع جنبا إلى جنب مع الكيمياء الهيستولوجية المناعية في عمليات التبريد لأسماك الزرد طريقة قوية لتحليل أنماط التعبير لجينين. تم تطبيق مزيج من التهجين في الموقع والكيمياء المناعية على الزرد11. ومع ذلك ، تم استخدام علاج البروتيناز K لتعزيز تغلغل المسبار على حساب سلامة المستضد. للتغلب على هذا القيد ، يستخدم هذا البروتوكول التسخين للحث على استرجاع المستضد. لا ينطبق هذا البروتوكول فقط على الأجنة ذات المراحل المختلفة وأقسام الأنسجة ذات السماكات المختلفة (أقسام الرأس 14 ميكرومتر وأقسام الحبل الشوكي 20 ميكرومتر) ، ولكن تم التحقق منه أيضا باستخدام الجينات المعبر عنها في عضوين ، بما في ذلك الرأس والحبل الشوكي.
سوف تصف هذه المقالة كيفية الجمع بين التهجين في الموقع وتلطيخ الأجسام المضادة في أجنة الزرد في عمليات التبريد. يتم إثبات تنوع هذا البروتوكول باستخدام عدد من تركيبات التهجين والكيمياء الهيستولوجية المناعية في الموقع ، بما في ذلك مجسات التهجين في الموقع لخليتين عصبيتين مختلفتين. هذه الطريقة مناسبة للكشف عن mRNA والبروتين في مناطق مختلفة والأجنة من مختلف الأعمار ، وكذلك أنماط التعبير عن جينين.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقترح هذا البروتوكول مزيجا من التهجين في الموقع والكيمياء الهيستولوجية المناعية ، وهي خطوة مهمة في تجارب التوطين المشترك على أجنة الزرد. تعمل هذه الطريقة كطريقة سهلة وفعالة لتحليل mRNA واحد وبروتين واحد في وقت واحد. تم إجراء التهجين في الموقع وتلطيخ الأجسام المضادة على أجنة الزرد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة نانتونغ للعلوم والتكنولوجيا في الصين (MS12019011) ، ومؤسسة نانتونغ للعلوم والتكنولوجيا في الصين (JC2021058) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (21KJB180009).
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
