原位 冷冻切片斑马鱼胚胎中的杂交结合免疫组织化学
Summary
该协议描述了如何通过结合斑马鱼胚胎切片的 原位 杂交和免疫组织化学来获取图像。在冷冻切片之前进行 原位 杂交，然后进行抗体染色。如果抗体缺乏，检测斑马鱼中两个基因的表达模式是有用的。
Abstract
作为一种脊椎动物，斑马鱼已被广泛用于生物学研究。斑马鱼和人类具有很高的遗传同源性，这使其可以用作人类疾病的模型。基因功能研究基于基因表达模式的检测。尽管免疫组织化学提供了一种测定蛋白表达的有效方法，但斑马鱼中市售抗体的数量有限，限制了成本分配的应用。 原位 杂交广泛用于斑马鱼胚胎中以检测mRNA表达。该协议描述了如何通过结合斑马鱼胚胎切片的 原位 杂交和免疫组织化学来获取图像。在冷冻切片之前进行 原位 杂交，然后进行抗体染色。原 位 杂交后进行免疫组织化学和单次冷冻切片成像。该方案有助于揭示两个基因的表达模式，首先通过 原位 转录本检测，然后通过针对同一部分中蛋白质的免疫组织化学。
Introduction
斑马鱼是用于发育和遗传学研究的强大脊椎动物模型1,2。斑马鱼和人类具有很高的遗传同源性（70%的基因与人类基因组共享），这使其可以用作人类疾病的模型3。在斑马鱼中，检测两个基因的表达模式及其空间关系是很常见的。免疫组织化学于 1941 年首次用于通过应用 FITC 标记的抗体来检测感染组织中的病原体4.组织切片中的靶蛋白首先用一抗标记，然后用针对一抗宿主物种免疫球蛋白的二抗标记切片。抗体染色是检测蛋白质定位的可靠方法，可在细胞内水平上提供高光学分辨率。然而，斑马鱼中可用的抗体数量非常有限。最近的一项研究表明，大约有112,000种抗体可供小鼠使用;然而，很少有抗体被证明在斑马鱼5中是可靠的。
相反，在斑马鱼中，原位杂交已被广泛用于基因表达模式分析。该方法在1980年代6,7首次用于评估果蝇胚胎中的基因表达，从那时起，该技术得到了不断发展和改进。最初，放射性标记的DNA探针用于检测mRNA转录本;然而，空间分辨率相对较低，并且存在放射性引起的潜在健康风险。随后，原位杂交依赖于用地高辛（DIG）或荧光素（Fluo）标记的RNA探针，这些探针与碱性磷酸酶（AP）偶联或通过荧光酪胺信号放大（TSA）检测8,9。尽管TSA已被用于检测两个或三个基因，但RNA探针的DIG标记和抗DIG AP偶联抗体仍然是高度敏感，稳定且广泛使用的原位杂交方法。因此，商业化抗体与DIG标记的原位探针相结合，有助于深入了解一个基因的蛋白质定位和表达。
由于光学分辨率低，整个胚胎无法揭示基因之间的空间关系，即使斑马鱼胚胎小而透明10。因此，切片对于在细胞内水平上分析基因的表达模式是必要的。冷冻切片已广泛用于斑马鱼，因为它易于操作并且可以有效地保存抗原。因此，斑马鱼冷冻切片中的 原位 杂交结合免疫组织化学为分析两个基因的表达模式提供了一种强有力的方法。 原位 杂交和免疫组织化学的组合已应用于斑马鱼11。然而，蛋白酶K处理用于以牺牲抗原完整性为代价来增强探针穿透。为了克服这一限制，该方案使用加热来诱导抗原修复。该方案不仅适用于不同阶段的胚胎和不同厚度的组织切片（14μm头部切片和20μm脊髓切片），而且还通过使用在两个器官中表达的基因进行了验证，包括头部和脊髓。
本文将介绍如何在冷冻切片中结合斑马鱼胚胎的 原位 杂交和抗体染色。通过使用许多 原位 杂交 – 免疫组织化学组合，包括针对两个不同神经元的 原位 杂交探针，证明了该协议的多功能性。该方法适用于检测不同区域和不同年龄胚胎的mRNA和蛋白质，以及两个基因的表达模式。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议提出了原位杂交和免疫组织化学的组合，这是斑马鱼胚胎共定位实验的重要一步。该方法是同时分析一种mRNA和一种蛋白质的简单有效的方法。对斑马鱼胚胎进行原位杂交和抗体染色。与之前发表的几种方案14,15,16相比，免疫荧光和免疫组织化学用于探索蛋白质表达。很少有斑马鱼特异性抗体经过适当验证，…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国南通市科学技术基金（MS12019011）、中国南通市科学技术基金（JC2021058）和江苏省高等学校自然科学基金（21KJB180009）的支持。
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
