その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション
Summary
このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ ハイブリダイゼーションを行い、続いて抗体染色を行った。ゼブラフィッシュの2つの遺伝子の発現パターンを検出することは、抗体が不足している場合に有用です。
Abstract
脊椎動物として、ゼブラフィッシュは生物学的研究で広く使用されています。ゼブラフィッシュとヒトは高い遺伝的相同性を共有しているため、ヒトの病気のモデルとして使用できます。遺伝子機能研究は、遺伝子発現パターンの検出に基づいています。免疫組織化学はタンパク質発現をアッセイする強力な方法を提供しますが、ゼブラフィッシュの市販抗体の数が限られているため、共染色の適用が制限されます。 in situ ハイブリダイゼーションは、mRNA発現を検出するためにゼブラフィッシュ胚において広く使用されている。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ ハイブリダイゼーションを行い、続いて抗体染色を行った。免疫組織化学および単一凍結切片のイメージングは、 in situ ハイブリダイゼーション後に実施した。このプロトコルは、最初に in situ 転写産物検出によって、次に同じセクションのタンパク質に対する免疫組織化学によって、2つの遺伝子の発現パターンを解明するのに役立ちます。
Introduction
ゼブラフィッシュは、発生と遺伝学の研究のための強力な脊椎動物モデルです1,2。ゼブラフィッシュとヒトは高い遺伝的相同性を共有しており(遺伝子の70%がヒトゲノムと共有されています)、ヒトの病気のモデルとして使用できます3。ゼブラフィッシュでは、2つの遺伝子の発現パターンとそれらの空間的関係を検出することは非常に一般的です。免疫組織化学は、FITC標識抗体を適用して感染組織内の病原体を検出するために1941年に最初に使用されました4。組織切片の標的タンパク質は、最初に一次抗体で標識され、次に切片は一次抗体の宿主種免疫グロブリンに対する二次抗体で標識されます。抗体染色は、タンパク質の局在を検出するための堅牢なアプローチであり、細胞内レベルで高い光学分解能を提供します。しかし、ゼブラフィッシュでは利用可能な抗体の数は非常に限られています。最近の研究では、約112,000の抗体がマウス用に市販されていることを示しています。しかしながら、ゼブラフィッシュ5において信頼性が実証されている抗体はほとんどない。
代わりに、ゼブラフィッシュでは、in situハイブリダイゼーションが遺伝子発現パターン解析に広く適用されている。この方法は、1980年代にショウジョウバエ胚の遺伝子発現を評価するために最初に使用され6,7、それ以来、この技術は継続的に開発および改良されてきました。当初、放射性標識されたDNAプローブを使用してmRNA転写物を検出しました。しかし、空間分解能は比較的低く、放射能によって引き起こされる潜在的な健康リスクがありました。その後、in situハイブリダイゼーションは、アルカリホスファターゼ(AP)に結合するか、蛍光チラミドシグナル増幅(TSA)によって検出されるジゴキシゲニン(DIG)またはフルオレセイン(Fluo)で標識されたRNAプローブに依存しています8,9。TSAは2つまたは3つの遺伝子の検出に使用されてきましたが、RNAプローブと抗DIG AP結合抗体のDIG標識は依然として高感度で安定しており、in situハイブリダイゼーションに広く使用されているアプローチです。したがって、DIG標識in situプローブと組み合わせた市販された抗体は、タンパク質の局在と1つの遺伝子の発現に関する洞察を提供するのに有用です。
ゼブラフィッシュの胚は小さく透明であるにもかかわらず、全マウント胚は光学分解能が低いため、遺伝子間の空間的関係を明らかにすることはできません10。そのため、細胞内レベルで遺伝子の発現パターンを解析するためには切片作成が必要です。凍結切開は、実行が容易で抗原を効果的に保存できるため、ゼブラフィッシュで広く使用されています。したがって、ゼブラフィッシュ凍結切片における免疫組織化学と組み合わせた in situ ハイブリダイゼーションは、2つの遺伝子の発現パターンを分析するための強力な方法を提供します。 in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせがゼブラフィッシュ11に適用されています。しかし、プロテイナーゼK処理は、抗原の完全性を犠牲にしてプローブの浸透を促進するために使用されました。この制限を克服するために、このプロトコルは加熱を使用して抗原賦活化を誘導します。このプロトコルは、さまざまなステージの胚やさまざまな厚さの組織切片(14μmの頭部切片と20μmの脊髄切片)に適用できるだけでなく、頭部と脊髄を含む2つの臓器で発現する遺伝子を使用して検証されています。
この記事では、凍結切片におけるゼブラフィッシュ胚における in situ ハイブリダイゼーションと抗体染色を組み合わせる方法について説明します。このプロトコルの汎用性は、2つの異なるニューロンに対するin situ ハイブリダイゼーションプローブを含む、多数の in situ ハイブリダイゼーション-免疫組織化学の組み合わせを使用することによって実証されます。この方法は、異なる領域および異なる年齢の胚におけるmRNAおよびタンパク質、ならびに2つの遺伝子の発現パターンを検出するのに適している。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の共局在実験における重要なステップであるin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせを提案しています。この方法は、1つのmRNAと1つのタンパク質を同時に分析するための簡単で効率的な方法として機能します。in situハイブリダイゼーションおよび抗体染色をゼブラフィッシュ胚に対して行った。以前に公開されたいく?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国の南通科学技術財団(MS12019011)、中国の南通科学技術財団(JC2021058)、および江蘇高等教育機関の自然科学財団(21KJB180009)によってサポートされました。
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
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