현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화
Summary
이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 절편의 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 항체가 부족한 경우 제브라피쉬에서 두 유전자의 발현 패턴을 감지하는 것이 유용합니다.
Abstract
척추 동물로서 제브라 피쉬는 생물학적 연구에 널리 사용되었습니다. 제브라피쉬와 인간은 높은 유전적 상동성을 공유하여 인간 질병의 모델로 사용할 수 있습니다. 유전자 기능 연구는 유전자 발현 패턴의 검출을 기반으로 합니다. 면역조직화학은 단백질 발현을 분석하는 강력한 방법을 제공하지만, 제브라피쉬에서 상업적으로 이용 가능한 항체의 수가 제한되어 있어 코스테인의 적용이 제한됩니다. 제브라피쉬 배아에서 mRNA 발현을 검출하기 위해 제자리 하이브리드화( in situ hybridization)가 널리 사용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 섹션에 대한 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 면역조직화학 및 단일 cryosection의 이미징은 in situ hybridization 후에 수행되었습니다. 이 프로토콜은 먼저 현장 전사체 검출에 의해 두 유전자의 발현 패턴을 밝히는 데 도움이 되며, 그 다음에는 동일한 섹션의 단백질에 대한 면역조직화학에 의해 도움이 됩니다.
Introduction
제브라피쉬는 발달 및 유전학 연구를 위한 강력한 척추동물 모델입니다 1,2. 제브라피쉬와 인간은 높은 유전적 상동성(유전자의 70%가 인간 게놈과 공유됨)을 공유하여 인간 질병의 모델로 사용할 수 있습니다3. 제브라피쉬에서는 두 유전자의 발현 패턴과 공간적 관계를 감지하는 것이 일반적입니다. 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 1941년에 FITC 표지 항체를 적용하여 감염된 조직에서 병원체를 검출하기 위해 처음 사용되었다4. 조직 섹션의 표적 단백질은 먼저 1차 항체로 표지되고, 그 다음에는 1차 항체의 숙주 종인 면역글로불린에 대한 2차 항체로 표지됩니다. 항체 염색은 단백질의 국소화를 검출하는 강력한 접근 방식으로, 세포 내 수준에서 높은 광학 분해능을 제공합니다. 그러나 제브라피쉬에서 사용할 수 있는 항체의 수는 매우 제한적입니다. 최근 연구에 따르면 약 112,000 개의 항체가 생쥐에 상업적으로 이용 가능합니다. 그러나 Zebrafish5에서 신뢰할 수 있는 것으로 입증된 항체는 거의 없습니다.
대신, 제브라피쉬에서 in situ 하이브리드화는 유전자 발현 패턴 분석에 널리 적용되었습니다. 이 방법은 1980년대초파리 배아의 유전자 발현을 평가하기 위해 처음 사용되었으며, 6,7, 그 이후로 이 기술은 지속적으로 개발되고 개선되었습니다. 초기에, 방사성 표지 DNA 프로브는 mRNA 전사체를 검출하기 위해 사용되었다; 그러나 공간 해상도는 상대적으로 낮았고 방사능으로 인한 잠재적인 건강 위험이 있었습니다. 그 후, 현장 하이브리드화는 디곡시제닌(DIG) 또는 플루오레세인(Fluo)으로 표지된 RNA 프로브에 의존하며, 이는 알칼리성 포스파타제(AP)에 접합되거나 형광 티라마이드 신호 증폭(TSA)에 의해 검출됩니다8,9. TSA가 2개 또는 3개의 유전자를 검출하는 데 사용되었지만 RNA 프로브의 DIG 라벨링 및 antiDIG AP 접합 항체는 여전히 고감도, 안정적이며 현장 혼성화를 위해 널리 사용되는 접근 방식입니다. 따라서 DIG 표지된 in situ 프로브와 결합된 상용화된 항체는 단백질 국소화 및 한 유전자의 발현에 대한 통찰력을 제공하는 데 유용합니다.
전체 마운트 배아는 낮은 광학 해상도로 인해 유전자 간의 공간적 관계를 밝힐 수 없지만, 제브라피쉬 배아는 작고 투명합니다10. 따라서 세포 내 수준에서 유전자의 발현 패턴을 분석하기 위해서는 절편이 필요합니다. Cryosectioning은 수행하기 쉽고 항원을 효과적으로 보존할 수 있기 때문에 제브라피쉬에서 널리 사용되었습니다. 따라서 제브라피쉬 냉동절편의 면역조직화학과 결합된 현장 혼성화는 두 유전자의 발현 패턴을 분석하는 강력한 방법을 제공합니다. 제브라피쉬11에 제자리 혼성화와 면역조직화학의 조합이 적용되었습니다. 그러나, 프로테이나제 K 처리는 항원 완전성을 희생시키면서 프로브 침투를 향상시키기 위해 사용되었다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 이 프로토콜은 항원 회수를 유도하기 위해 가열을 사용한다. 이 프로토콜은 다양한 두께의 다른 단계 및 조직 절편(14μm 머리 절편 및 20μm 척수 절편)의 배아에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 두부와 척수를 포함한 두 기관에서 발현되는 유전자를 사용하여 검증되었습니다.
이 기사에서는 cryosections에서 제브라피쉬 배아에서 in situ hybridization과 항체 염색을 결합하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 다양성은 두 개의 서로 다른 뉴런에 대한 in situ 하이브리드화 프로브를 포함하여 다수의 in situ 하이브리드 화-면역조직화학 조합을 사용하여 입증됩니다. 이 방법은 서로 다른 영역과 다른 연령의 배아에서 mRNA와 단백질을 검출하는 데 적합하며 두 유전자의 발현 패턴을 검출하는 데 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 제브라피쉬 배아에 대한 colocalization 실험에서 중요한 단계인 현장 혼성화와 면역조직화학의 조합을 제안합니다. 이 방법은 하나의 mRNA와 하나의 단백질을 동시에 분석하는 쉽고 효율적인 방법입니다. 제브라피쉬 배아에 대해 제자리 하이브리드화 및 항체 염색을 수행했습니다. 이전에 발표된 여러 프로토콜과 대조적으로14,15,16<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 중국 난퉁 과학 기술 재단 (MS12019011), 중국 난퉁 과학 기술 재단 (JC2021058) 및 장쑤 고등 교육 기관 자연 과학 재단 (21KJB180009)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
