In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados
Summary
Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica de cortes embrionários de zebrafish. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. É útil detectar os padrões de expressão de dois genes em peixes-zebra se houver escassez de anticorpos.
Abstract
Como vertebrado, o zebrafish tem sido amplamente utilizado em estudos biológicos. Zebrafish e humanos compartilham alta homologia genética, o que permite seu uso como modelo para doenças humanas. O estudo da função gênica baseia-se na detecção de padrões de expressão gênica. Embora a imunohistoquímica ofereça uma maneira poderosa de avaliar a expressão de proteínas, o número limitado de anticorpos comercialmente disponíveis em zebrafish restringe a aplicação de costaína. A hibridização in situ é amplamente utilizada em embriões de peixe-zebra para detectar a expressão de RNAm. Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica para cortes de embriões de peixe-zebra. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. A imuno-histoquímica e a obtenção de imagens de uma única criossecção foram realizadas após hibridização in situ . O protocolo é útil para desvendar o padrão de expressão de dois genes, primeiro pela detecção in situ do transcrito e depois pela imunohistoquímica contra uma proteína na mesma seção.
Introduction
O zebrafish é um poderoso modelo de vertebrado para estudos de desenvolvimento egenética1,2. Zebrafish e humanos compartilham alta homologia genética (70% dos genes são compartilhados com o genoma humano), o que permite seu uso como modelo para doenças humanas3. No peixe-zebra, é bastante comum detectar os padrões de expressão de dois genes e sua relação espacial. A imuno-histoquímica foi utilizada pela primeira vez em 1941 para detectar patógenos em tecidos infectados por meio da aplicação de anticorpos marcados com FITC4. A proteína-alvo na seção de tecido é primeiramente marcada com um anticorpo primário, e a seção é então marcada com um anticorpo secundário contra a imunoglobulina da espécie hospedeira do anticorpo primário. A coloração de anticorpos é uma abordagem robusta para detectar a localização de proteínas, que oferece alta resolução óptica em nível intracelular. No entanto, o número de anticorpos disponíveis é muito limitado em peixes-zebra. Um estudo recente mostra que aproximadamente 112.000 anticorpos estão comercialmente disponíveis para camundongos; no entanto, muito poucos anticorpos demonstraram ser confiáveis em zebrafish5.
Em vez disso, em peixes-zebra, a hibridização in situ tem sido amplamente aplicada para análise de padrões de expressão gênica. Esse método foi utilizado pela primeira vez para avaliar a expressão gênica em embriões de Drosophila na década de 19806,7 e, desde então, essa tecnologia vem sendo continuamente desenvolvida e aprimorada. Inicialmente, sondas de DNA radiomarcadas foram usadas para detectar transcritos de RNAm; no entanto, a resolução espacial foi relativamente baixa, e houve riscos potenciais à saúde causados pela radioatividade. Posteriormente, a hibridização in situ depende das sondas de RNA marcadas com digoxigenina (DIG) ou fluoresceína (Fluo), que são conjugadas à fosfatase alcalina (FA) ou detectadas por amplificação fluorescente do sinal da tiramida (TSA)8,9. Embora a TSA tenha sido usada para detectar dois ou três genes, a marcação DIG de sondas de RNA e o anticorpo conjugado antiDIG AP ainda são abordagens altamente sensíveis, estáveis e amplamente utilizadas para hibridização in situ. Portanto, anticorpos comercializados combinados com sondas in situ marcadas com DIG são úteis para fornecer informações sobre a localização e expressão de proteínas de um gene.
Embriões de montagem total não podem revelar a relação espacial entre genes devido à baixa resolução óptica, embora os embriões de peixe-zebra sejam pequenos e transparentes10. Assim, o corte é necessário para analisar os padrões de expressão de genes em nível intracelular. A criossecção tem sido amplamente utilizada em peixes-zebra, pois é de fácil execução e pode efetivamente preservar o antígeno. Portanto, a hibridização in situ combinada com imunohistoquímica em criossecções de peixe-zebra oferece uma maneira poderosa de analisar os padrões de expressão de dois genes. Uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica foi aplicada ao zebrafish11. No entanto, o tratamento com proteinase K foi usado para aumentar a penetração da sonda em detrimento da integridade do antígeno. Para superar essa limitação, este protocolo utiliza o aquecimento para induzir a recuperação antigênica. Este protocolo não só é aplicável a embriões de diferentes estágios e cortes de tecidos de várias espessuras (cortes de cabeça de 14 μm e cortes medulares de 20 μm), mas também foi verificado usando genes expressos em dois órgãos, incluindo a cabeça e a medula espinhal.
Este artigo descreverá como combinar hibridização in situ e coloração de anticorpos em embriões de zebrafish em criossecções. A versatilidade deste protocolo é demonstrada pelo uso de várias combinações de hibridização in situ-imunohistoquímica, incluindo sondas de hibridização in situ para dois neurônios diferentes. Este método é adequado para detectar mRNA e proteína em diferentes regiões e embriões de diferentes idades, bem como os padrões de expressão de dois genes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo propõe uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica, um passo importante nos experimentos de colocalização em embriões de zebrafish. Este método serve como uma maneira fácil e eficiente de analisar simultaneamente um RNAm e uma proteína. Hibridização in situ e coloração de anticorpos foram realizadas em embriões de zebrafish. Em contraste com vários protocolos publicadosanteriormente14,15,16,<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), pela Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) e pela Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
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