In situ Hybridisering kombinerad med immunhistokemi i kryosektionerade zebrafiskembryon
Summary
Detta protokoll beskriver hur man får bilder genom att kombinera in situ hybridisering och immunhistokemi av zebrafisk embryonala sektioner. In situ-hybridisering utfördes före kryosektion, följt av antikroppsfärgning. Det är användbart att detektera uttrycksmönstren för två gener i zebrafisk om det finns en brist på antikroppar.
Abstract
Som ryggradsdjur har zebrafisken använts i stor utsträckning i biologiska studier. Zebrafisk och människor delar hög genetisk homologi, vilket möjliggör användning som modell för mänskliga sjukdomar. Genfunktionsstudien baseras på detektion av genuttrycksmönster. Även om immunhistokemi erbjuder ett kraftfullt sätt att analysera proteinuttryck, begränsar det begränsade antalet kommersiellt tillgängliga antikroppar i zebrafisk tillämpningen av costaining. In situ-hybridisering används ofta i zebrafiskembryon för att detektera mRNA-uttryck. Detta protokoll beskriver hur man får bilder genom att kombinera in situ hybridisering och immunhistokemi för zebrafiskembryosektioner. In situ-hybridisering utfördes före kryosektion, följt av antikroppsfärgning. Immunhistokemi och avbildning av en enda kryosektion utfördes efter in situ-hybridisering. Protokollet är till hjälp för att reda ut uttrycksmönstret för två gener, först genom in situ-transkriptdetektion och sedan genom immunhistokemi mot ett protein i samma sektion.
Introduction
Zebrafisken är en kraftfull ryggradsdjurmodell för studier av utveckling och genetik 1,2. Zebrafisk och människor delar hög genetisk homologi (70% av generna delas med det mänskliga genomet), vilket möjliggör användning som modell för mänskliga sjukdomar3. I zebrafisk är det ganska vanligt att upptäcka uttrycksmönstren för två gener och deras rumsliga förhållande. Immunohistokemi användes först 1941 för att detektera patogener i infekterade vävnader genom att applicera FITC-märkta antikroppar4. Målproteinet i vävnadssektionen märks först med en primär antikropp, och sektionen märks sedan med en sekundär antikropp mot den primära antikroppens värdart immunglobulin. Antikroppsfärgning är ett robust tillvägagångssätt för att detektera lokalisering av proteiner, vilket ger hög optisk upplösning på intracellulär nivå. Antalet tillgängliga antikroppar är dock mycket begränsat hos zebrafiskar. En nyligen genomförd studie visar att cirka 112 000 antikroppar är kommersiellt tillgängliga för möss; Mycket få antikroppar har dock visat sig vara tillförlitliga i zebrafisk5.
Istället har in situ-hybridisering i zebrafisk använts i stor utsträckning för analys av genuttrycksmönster. Denna metod användes först för att bedöma genuttryck i Drosophila-embryon på 1980-talet6,7, och sedan dess har denna teknik kontinuerligt utvecklats och förbättrats. Ursprungligen användes radiomärkta DNA-sonder för att detektera mRNA-transkript; Den rumsliga upplösningen var dock relativt låg och det fanns potentiella hälsorisker orsakade av radioaktiviteten. Därefter förlitar sig in situ-hybridisering på RNA-sonderna märkta med digoxigenin (DIG) eller fluorescein (Fluo), vilka är konjugerade till alkaliskt fosfatas (AP) eller detekteras genom fluorescerande tyramidsignalförstärkning (TSA)8,9. Även om TSA har använts för att detektera två eller tre gener, är DIG-märkning av RNA-sonder och antiDIG AP-konjugerade antikroppar fortfarande mycket känsliga, stabila och allmänt använda metoder för in situ-hybridisering. Därför är kommersialiserade antikroppar i kombination med DIG-märkta in situ-sonder användbara för att ge insikt i proteinlokalisering och uttryck av en gen.
Helmonterade embryon kan inte avslöja det rumsliga förhållandet mellan gener på grund av den låga optiska upplösningen, även om zebrafiskembryon är små och transparenta10. Därför är sektionering nödvändig för att analysera uttrycksmönster av gener på intracellulär nivå. Kryosektion har använts i stor utsträckning i zebrafisk eftersom det är lätt att utföra och effektivt kan bevara antigenet. Därför erbjuder in situ-hybridisering i kombination med immunhistokemi i zebrafiskkryosektioner ett kraftfullt sätt att analysera uttrycksmönstren för två gener. En kombination av in situ-hybridisering och immunhistokemi har applicerats på zebrafisk11. Proteinas K-behandling användes emellertid för att förbättra sondpenetrationen på bekostnad av antigenintegriteten. För att övervinna denna begränsning använder detta protokoll uppvärmning för att inducera antigenhämtning. Detta protokoll är inte bara tillämpligt på embryon i olika stadier och vävnadssektioner av olika tjocklek (14 μm huvudsektioner och 20 μm ryggmärgssektioner), men det har också verifierats genom att använda gener uttryckta i två organ, inklusive huvudet och ryggmärgen.
Denna artikel kommer att beskriva hur man kombinerar in situ hybridisering och antikroppsfärgning i zebrafiskembryon i kryosektioner. Mångsidigheten hos detta protokoll demonstreras genom att använda ett antal in situ hybridisering-immunhistokemiska kombinationer, inklusive in situ-hybridiseringsprober för två olika neuroner. Denna metod är lämplig för detektion av mRNA och protein i olika regioner och embryon av olika åldrar, liksom uttrycksmönstren för två gener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll föreslår en kombination av in situ-hybridisering och immunhistokemi, ett viktigt steg i samlokaliseringsexperimenten på zebrafiskembryon. Denna metod fungerar som ett enkelt och effektivt sätt att samtidigt analysera ett mRNA och ett protein. In situ-hybridisering och antikroppsfärgning utfördes på zebrafiskembryon. I motsats till flera protokoll publicerade tidigare14,15,16 användes imm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) och Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
