In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon
Summary
Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.
Abstract
Bir omurgalı olarak, zebra balığı biyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı ve insanlar, insan hastalıkları için bir model olarak kullanılmasına izin veren yüksek genetik homolojiyi paylaşırlar. Gen fonksiyon çalışması, gen ekspresyon paternlerinin tespitine dayanmaktadır. İmmünohistokimya, protein ekspresyonunu test etmek için güçlü bir yol sunsa da, zebra balığında ticari olarak temin edilebilen sınırlı sayıda antikor, costaining uygulamasını kısıtlamaktadır. In situ hibridizasyon, zebra balığı embriyolarında mRNA ekspresyonunu tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, zebra balığı embriyo kesitleri için in situ hibridizasyon ve immünohistokimyayı birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklamaktadır. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. İmmünohistokimya ve tek kriyokesimin görüntülenmesi in situ hibridizasyon sonrası yapıldı. Protokol, iki genin ekspresyon paternini, önce in situ transkript tespiti ve daha sonra aynı bölümdeki bir proteine karşı immünohistokimya ile çözmeye yardımcı olur.
Introduction
Zebra balığı, gelişim ve genetik çalışmaları için güçlü bir omurgalı modelidir 1,2. Zebra balığı ve insanlar yüksek genetik homolojiyi paylaşırlar (genlerin% 70’i insan genomu ile paylaşılır), bu da insan hastalıkları için bir model olarak kullanılmasına izin verir3. Zebra balığında, iki genin ekspresyon kalıplarını ve mekansal ilişkilerini tespit etmek oldukça yaygındır. İmmünohistokimya ilk olarak 1941’de FITC etiketli antikorlar4 uygulayarak enfekte dokulardaki patojenleri tespit etmek için kullanılmıştır. Doku bölümündeki hedef protein ilk önce birincil bir antikor ile etiketlenir ve bölüm daha sonra birincil antikorun konakçı türü immünoglobuline karşı ikincil bir antikor ile etiketlenir. Antikor boyama, hücre içi düzeyde yüksek optik çözünürlük sunan proteinlerin lokalizasyonunu tespit etmek için sağlam bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, zebra balıklarında mevcut antikorların sayısı çok sınırlıdır. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, fareler için yaklaşık 112.000 antikorun ticari olarak mevcut olduğunu göstermektedir; Bununla birlikte, zebra balığı5’te çok az antikorun güvenilir olduğu gösterilmiştir.
Bunun yerine, zebra balıklarında, in situ hibridizasyon, gen ekspresyon paterni analizi için yaygın olarak uygulanmıştır. Bu yöntem ilk olarak 1980’lerde Drosophila embriyolarında gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır 6,7 ve o zamandan beri bu teknoloji sürekli olarak geliştirilmiş ve iyileştirilmiştir. Başlangıçta, mRNA transkriptlerini tespit etmek için radyoaktif işaretli DNA probları kullanıldı; Bununla birlikte, uzamsal çözünürlük nispeten düşüktü ve radyoaktivitenin neden olduğu potansiyel sağlık riskleri vardı. Daha sonra, in situ hibridizasyon, alkali fosfataza (AP) konjuge edilen veya floresan tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) ile tespit edilen digoxigenin (DIG) veya floresein (Fluo) ile etiketlenmiş RNA problarına dayanır8,9. TSA, iki veya üç geni tespit etmek için kullanılmasına rağmen, RNA problarının DIG etiketlemesi ve antiDIG AP-konjuge antikor, in situ hibridizasyon için hala oldukça hassas, kararlı ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardır. Bu nedenle, DIG etiketli in situ problarla birleştirilen ticarileştirilmiş antikorlar, protein lokalizasyonu ve bir genin ekspresyonu hakkında fikir vermek için yararlıdır.
Tam montajlı embriyolar, zebra balığı embriyoları küçük ve şeffaf10 olmasına rağmen, düşük optik çözünürlük nedeniyle genler arasındaki uzamsal ilişkiyi ortaya çıkaramazlar. Bu nedenle, hücre içi düzeyde genlerin ekspresyon kalıplarını analiz etmek için kesitleme gereklidir. Kriyoseksiyon, zebra balıklarında yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü gerçekleştirilmesi kolaydır ve antijeni etkili bir şekilde koruyabilir. Bu nedenle, zebra balığı kriyoseksiyonlarında immünohistokimya ile kombine edilen in situ hibridizasyon, iki genin ekspresyon modellerini analiz etmek için güçlü bir yol sunar. Zebra balığı11’e in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonu uygulanmıştır. Bununla birlikte, proteinaz K tedavisi, antijen bütünlüğü pahasına prob penetrasyonunu arttırmak için kullanılmıştır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu protokol antijen alımını indüklemek için ısıtma kullanır. Bu protokol sadece farklı aşamalardaki embriyolara ve çeşitli kalınlıklardaki doku kesitlerine (14 μm kafa bölümleri ve 20 μm omurilik bölümleri) uygulanamaz, aynı zamanda baş ve omurilik de dahil olmak üzere iki organda eksprese edilen genler kullanılarak doğrulanmıştır.
Bu makalede, zebra balığı embriyolarında kriyoseksiyonlarda in situ hibridizasyon ve antikor boyamanın nasıl birleştirileceği anlatılacaktır. Bu protokolün çok yönlülüğü, iki farklı nöron için in situ hibridizasyon probları da dahil olmak üzere bir dizi in situ hibridizasyon-immünohistokimya kombinasyonu kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntem, farklı bölgelerdeki mRNA ve proteini ve farklı yaşlardaki embriyoları ve ayrıca iki genin ekspresyon modellerini tespit etmek için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, zebra balığı embriyoları üzerindeki kolokalizasyon deneylerinde önemli bir adım olan in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonunu önermektedir. Bu yöntem, bir mRNA ve bir proteini aynı anda analiz etmenin kolay ve etkili bir yolu olarak hizmet eder. Zebra balığı embriyolarında in situ hibridizasyon ve antikor boyama yapıldı. Daha önce14,15,16 yayınlanan çeşitli protokollerin aksine,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Nantong Bilim ve Teknoloji Vakfı (MS12019011), Çin Nantong Bilim ve Teknoloji Vakfı (JC2021058) ve Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumları Doğa Bilimleri Vakfı (21KJB180009) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
