זיהוי וכימות של תאים שומרי תוויות בחותכות עכבר באמצעות גישת שחזור תלת-ממדית לאחר ניקוי רקמות
Summary
החותכת לעכבר מכילה תאים שומרי תוויות יקרי ערך בנישת תאי הגזע שלה. יש לנו דרך חדשה לזהות ולכמת באופן בלתי משוחד את התאים שומרי התווית; המחקר שלנו השתמש בתיוג EdU ובגישת שחזור תלת ממדית לאחר ניקוי רקמות פגסוס של הלסת התחתונה.
Abstract
החותכת היא איבר הגדל ברציפות לאורך כל חיי העכבר. תאי הגזע האפיתל והמזנכימליים השוכנים ברקמות הפרוקסימליות של החותכות מולידים צאצאים שיתמינו לאמלובלסטים, אודונטובלסטים ופיברובלסטים של מוך השן. תאים אלה חיוניים לתמיכה בתחלופה מתמשכת של רקמות חותכות, מה שהופך את החותכת murine מודל מצוין לחקר הומאוסטזיס של תאי גזע בוגרים. מאמינים כי תאי גזע מכילים תאים שקטים מאריכי חיים שניתן לתייג על ידי אנלוגים של נוקלאוטידים כגון 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU). התאים שומרים על תווית זו לאורך זמן ובהתאם לכך נקראים תאים שומרי תוויות (LRCs). גישות להדמיה של LRCs in vivo מספקות כלי חזק לניטור הומאוסטזיס של תאי גזע. במחקר זה תיארנו שיטה להדמיה וניתוח של LRCs. הגישה החדשנית שלנו כוללת LRCs בחותכות עכבר לאחר ניקוי רקמות וצביעת EdU בהרכבה מלאה ולאחר מכן מיקרוסקופ קונפוקלי ושחזור תלת ממדי (3D) עם תוכנת ההדמיה. שיטה זו מאפשרת רכישת הדמיה תלת-ממדית וכימות לא מוטה בהשוואה לניתוח LRCs מסורתי על שקופיות חתוכות.
Introduction
החותכת לעכבר הגדלה ללא הרף היא מודל מצוין לחקר תאי גזע בוגרים1. תאי הגזע האפיתל (לולאה צווארית שפתית ולשונית) ותאי גזע מזנכימליים (בין הלולאה הצווארית השפתית והלשונית) השוכנים בצד הפרוקסימלי של החותכת מתמיינים לאמלובלסטים, אודונטובלסטים ותאי מוך השן. תהליך ייחודי זה מספק מקור תאים לפיצוי אובדן רקמות ותחלופת רקמה2. למרות מספר סמנים של תאי גזע כגון Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 וכו ‘. זוהו in vivo עבור תת-קבוצות של תאי גזע בוגרים בחותכות עכבר, הם אינם מספיקים בייצוג אוכלוסיות תאי הגזע כאשר משתמשים בהם לבד 1,3,4,5. הדמיה של תאים שקטים מאריכי חיים על ידי תיוג ושימור דנ”א אנלוגי של נוקלאוטידים יכולה לספק זיהוי בלתי משוחד עבור רוב תת-הקבוצות של תאי גזע בוגרים6. יתר על כן, גישה זו שימושית בקרב שיטות זיהוי תאי גזע רבות7 להבנת התנהגות התאים והומאוסטזיס של אוכלוסיות תאי גזע דנטליים 3,8. בעוד שתאי הגזע המתחלקים יאבדו את תיוג הדנ”א שלהם לאחר מרדף ניכר, תאי הגזע השקטים לכאורה שומרים על תווית הדנ”א שלהם, ורואים בהם תאים שומרי תוויות (LRCs)6. תיוג ושימור DNA על ידי תאי גזע שאינם מתחלקים יסמנו וימקמו את תאי הגזע הבוגרים לכאורה בנישות שלהם.
במהלך השנים האחרונות, תיוג אנלוגי של תימידין 5-ברומו-2′-דאוקסיורידין (BrdU) החליף את שיטת התיוג 3H-thymidine DNA המסורבלת, הגוזלת זמן רב וברזולוציה גבוהה שאינה תואמת 3H-thymidine DNA לבדיקות התפשטות תאים 6,9. בשנים האחרונות, טכניקת התיוג 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) נמצאת בשימוש הולך וגובר על BrdU. דפוס זה נוצר מכמה סיבות. ראשית, שיטת BrdU היא איטית ועתירת עבודה. תנאי המשתמש משתנים, והוא אינו מסוגל לשמר את מבנה העל בדגימות (עקב דנטורציה של DNA). כמו כן, שיטת BrdU מאבדת את האנטיגניות של תאים, ובכך הופכת אותה ללא יעילה עבור ניתוחים פונקציונליים במורד הזרם ובדיקות כגון ניסויי לוקליזציה משותפת והשתלת תאי גזע in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU הוא גם טרטוגן, שאינו מתאים לתיוג LRCs בהתפתחות עוברית6. כמו כן, שיטת BrdU אינה יעילה כאשר משתמשים בה בדגימות שלמות. החסרונות הם חדירה נמוכה של נוגדנים בחלק העמוק של הדגימות או דרישה לתקופת דגירה ארוכה של נוגדנים לחדירה עמוקה13. תיוג EdU חומק מהשלבים של דגימות דנטורציה, ובכך משמר את מבנה העל. תכונה זו מועילה לניתוחים פונקציונליים במורד הזרם, כגון ניסויי לוקליזציה משותפת והשתלת תאי גזע11,12. כמו כן, תיוג EdU רגיש ומהיר מאוד; חדירת הדגימות גבוהה הודות לשימוש באזידים פלואורסצנטיים נספגים במהירות ובגודל קטן יותר לזיהוי תוויות EdU באמצעות תגובת ציקלואיד (כימיית “קליק” Cu(I)-זרז [3 + 2]14.
שיטה נוספת לסימון דנ”א המיושמת יותר ויותר היא השימוש בעכברים טרנסגניים מהונדסים. עכברים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק היסטון 2B (H2B-GFP) הנשלט על ידי אלמנט מווסת מגיב טטרציקלין 5,14. לאחר האכלת עכברים בטטרציקלין צ’או/מים למשך תקופת מרדף של 4 שבועות עד 4 חודשים, פלואורסצנטיות GFP תפחת בתאי מחזור ורק LRCs ישמרו על פלואורסצנטיות6. היתרון של שיטה זו הוא שניתן לבודד את ה- LRCs המסומנים ולהישאר בני קיימא עבור תרבית תאים או ניתוחים פונקציונליים במורד הזרם 6,7. כמה מחקרים דיווחו על תיוג לא מדויק של תאי גזע שקטים כאשר רדפו אחריהם לשימוש ארוך טווח. תוצאה זו נבעה מביטוי רקע דולף מזן H2B-GFP ולא מהתגובה המווסתת הטטרציקליןהמתאימה 15.
יתר על כן, רוב הספרות בעבר השתמשה בזיהוי LRCs בעיקר על שקופיות חתוכות, שהן דו-ממדיות ולעתים קרובות מוטות בטעות בהצגת המיקום והמספר המדויקים של LRCs. הגישה הציגה זוויות שגויות למקטעים של מבני רקמות מורכבים16. השיטה השנייה הייתה להשיג תמונות תלת ממדיות מקטעים טוריים ולבצע שחזורים לאחר התמונה. שלבים אלה לא היו מדויקים בגלל עיוות תמונה מווריאציות בכל קטע טורי עקב קטעים דחוסים או מתוחים, וכתוצאה מכך חסר מידע16,17,18. השיטה הייתה גם מייגעת וגוזלת זמן.
כדי להקל על הדמיה מלאה של LRCs, הדגימות צריכות להיות ברורות בזמן שהפלואורסצנטיות מתוחזקת היטב. ניתן לסווג את טכניקות ניקוי הרקמה הנוכחיות לשלוש קטגוריות עיקריות: טכניקות ניקוי רקמות מבוססות ממס אורגני, טכניקות ניקוי רקמות מבוססות מגיב מימי, וטכניקות ניקוי רקמות מבוססות הידרוג’ל17,19. מערכת הממסים הקשורה לפוליאתילן גליקול (PEG) (פגסוס) פותחה לאחרונה. גישה זו הופכת כמעט את כל סוגי הרקמות לשקופים ומשמרת פלואורסצנטיות אנדוגנית, כולל רקמות קשות כגון עצם ושיניים20. לשיטת פגסוס יתרונות על פני שיטות ניקוי רקמות אחרות, בעיקר בניקוי חומרי שן ועצם. רוב השיטות האחרות יכולות לנקות רקמות קשות רק באופן חלקי, בעלות זמני עיבוד ארוכים, או דורשות ריאגנטים יקרים21. כמו כן, שיטת פגסוס יכולה לשמר ביעילות פלואורסצנטיות אנדוגנית על פני שיטות אחרות.
ספרות זו הובילה אותנו ליצור שיטה חדשה לחקר התא. שילבנו את יתרונות זיהוי ה-LRCs של תיוג EdU עם ההדמיה התלת-ממדית המעולה ביותר של דגימות שעברו ניקוי רקמות; הדגימות עובדו בטכניקת ניקוי רקמות מתקדמת של מערכת ממס משויכת פוליאתילן גליקול (PEG) (PEGASOS)15. שקיפות רקמות קשות אפשרה לנו לשחזר את האות התלת-ממדי של פלואורסצנטיות LRCs in vivo מבלי לשבור את השיניים או הלסתות, וליצור דרך מדויקת יותר לדמיין ולכמת LRCs.
במחקר זה, אנו מספקים מדריך חדשני להמחשת LRCs בחותך העכבר. יצרנו גישה חזותית תלת-ממדית כדי לקבוע את המיקום והכמות של LRCs בתוך נישת תאי הגזע החותכים לעכבר. פרויקט זה השתמש בתיוג EdU, טכניקות ניקוי רקמות פגסוס ומיקרוסקופ קונפוקלי. השיטה שלנו של תיוג EdU של LRCs על רקמה שלמה ושימוש בדגימה מנוקה ושקופה מתגברת הן על המגבלות של שקופיות חתוכות מסורתיות והן על שיטות תיוג DNA חסרות אחרות. לכן, הטכניקה שלנו תתאים למחקרים על הומאוסטזיס של תאי גזע הדורשים זיהוי LRCs, במיוחד על רקמות קשות. הפרוטוקול יכול להיות מועיל באותה מידה לאלה המתמקדים בהומאוסטזיס של תאי גזע ברקמות ואיברים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מינונים מרובים של זריקות (BrdU, EdU) משמשים בדרך כלל על עכברים ילודים גדלים כדי לתייג תאים מתרבים ככל האפשר 1,6,13. תקופת המרדף נחשבת לצעד קריטי לגבי קצב ההתחדשות של רקמות 6,13. החותכת לעכבר מחדשת את עצמה מדי חודש. תכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למייגן ק. הולט על עריכת כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH/NIDCR DE026461 ו- DE028345 ומימון סטארט-אפ מבית הספר לרפואת שיניים A&M בטקסס לד”ר Xiaofang Wang.
Materials
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712 (2017).
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
- de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595 (2021).
- Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
- Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
- Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).
- Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
- Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).
- Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).
