組織透明化後の3D再構成アプローチを用いたマウス切歯の標識保持細胞の検出と定量(英語)
Summary
マウス切歯には、幹細胞ニッチに貴重なラベル保持細胞が含まれています。私たちは、ラベル保持細胞を偏りなく検出して定量化する新しい方法を持っています。私たちの研究では、下顎骨のPEGASOS組織除去後のEdU標識と3D再構成アプローチを使用しました。
Abstract
マウス切歯は、マウスの寿命を通して継続的に成長する器官です。切歯の近位組織に存在する上皮幹細胞および間葉系幹細胞は、アメロブラスト、歯芽細胞、および歯髄線維芽細胞に分化する子孫を生じさせる。これらの細胞は、切歯組織の持続的なターンオーバーをサポートする上で非常に重要であり、マウス切歯を成体幹細胞の恒常性を研究するための優れたモデルにします。幹細胞は、5−エチニル−2’−デオキシウリジン(EdU)などのヌクレオチド類似体によって標識することができる長寿命の静止細胞を含むと考えられている。細胞は長期にわたってこのラベルを保持し、それに応じてラベル保持細胞(LRC)と呼ばれます。 LRCをin vivoで 可視化するアプローチは、幹細胞の恒常性をモニタリングするための堅牢なツールを提供します。本研究では、LRCを可視化・解析する手法について述べる。私たちの革新的なアプローチは、組織透明化後のマウス切歯のLRCとホールマウントEdU染色、それに続く共焦点顕微鏡検査、およびイメージングソフトウェアによる3次元(3D)再構成を特徴としています。この方法では、セクション化されたスライドでの従来のLRC分析と比較して、3Dイメージングの取得とバイアスのない定量が可能になります。
Introduction
継続的に成長するマウス切歯は、成体幹細胞を研究するための優れたモデルです1。切歯の近位側に存在する上皮(唇と舌の頸部ループ)と間葉系幹細胞(唇と舌の頸部ループの間)は、アメロブラスト、歯芽細胞、歯髄細胞に分化します。このユニークなプロセスは、組織の喪失と代謝回転を補償するための細胞の供給源を提供します2。Sox2、Gli1、Thy1 / CD90、Bmi1などのいくつかの幹細胞マーカーですが。マウス切歯における成体幹細胞のサブセットについてインビボで同定されているが、それらは単独で使用した場合の幹細胞集団を表すには不十分である1、3、4、5。ヌクレオチド類似体DNAの標識と保持によって長寿命の静止細胞を可視化することで、成体幹細胞のほとんどのサブセットを偏りなく検出できます6。さらに、このアプローチは、多くの幹細胞同定方法7の中で、歯科幹細胞集団の細胞挙動および恒常性を理解するために有用である3、8。分裂した幹細胞は、かなりの追跡の後にDNA標識を失いますが、推定静止幹細胞はDNA標識を保持し、ラベル保持細胞(LRC)と見なします6。非分裂幹細胞によるDNA標識と保持は、推定成体幹細胞をニッチにマークして配置します。
過去数年間、チミジン類似体5-ブロモ-2′-デオキシウリジン(BrdU)標識は、細胞増殖アッセイ用の面倒で時間のかかる高解像度顕微鏡法に適合しない3H-チミジンDNA標識法に取って代わりました6,9。近年、5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)標識技術がBrdUよりもますます使用されています。このパターンはいくつかの理由で現れました。まず、BrdU法は遅く、労働集約的です。使用条件はさまざまであり、検体の微細構造を保存することはできません(DNA変性のため)。同様に、BrdU法は細胞の抗原性を失うため、共局在実験やin vivo幹細胞移植などの下流の機能解析やアッセイには非効率的になります3、7、9、10、11、12。BrdUは催奇形性物質でもあり、胚発生におけるLRCの標識には適していません6。また、BrdU法は、ホールマウント試験片に使用すると非効率的です。欠点は、検体の深部での抗体の浸透性が低いこと、または深部浸透のために抗体のインキュベーション期間が長いことです13。EdU標識は、試料を変性させるステップを回避し、微細構造を保存します。この特徴は、共局在実験や幹細胞移植などの下流の機能解析に有利です11,12。また、EdUラベリングは非常に感度が高く迅速です。Cu(I)触媒による[3 + 2]環化付加反応(「クリック」化学)を介してEdU標識を検出するために、急速に吸収され、より小さなサイズの蛍光アジドを使用しているため、試料の浸透率は高くなります14。
ますます適用されている別のDNA標識法は、操作されたトランスジェニックマウスの使用です。これらのマウスは、テトラサイクリン応答性調節因子5,14によって制御されるヒストン2B緑色蛍光タンパク質(H2B-GFP)を発現する。マウスにテトラサイクリンチャウ/水を4週間から4ヶ月の追跡期間与えた後、GFP蛍光はサイクリング細胞で減少し、LRCのみが蛍光を保持します6。この方法の利点は、標識されたLRCを単離し、細胞培養または下流の機能解析のために生存し続けることができることです6,7。いくつかの研究は、長期使用のために追いかけられたときの静止幹細胞の不正確な標識を報告した。この結果は、H2B-GFP株からの漏出したバックグラウンド発現によるものであり、適切なテトラサイクリン調節応答によるものではなかった15。
さらに、過去のほとんどの文献では、LRCの検出を主に切片化されたスライドで使用していましたが、これは2次元であり、LRCの正確な位置と数を示すのに誤って偏っていることがよくあります。アプローチは、複雑な組織構造の切片に対して誤った角度を表示しました16。もう一つは、連続切片から3D画像を取得し、ポスト画像再構成を行う方法であった。これらのステップは、圧縮または引き伸ばされたセクションによる各シリアルセクションの変動による画像の歪みのために不正確であり、その結果、情報が欠落した16、17、18。この方法はまた、面倒で時間がかかりました。
LRCのホールマウントイメージングを容易にするには、蛍光を十分に維持しながらサンプルを透明化する必要があります。現在の組織透明化技術は、3つの主要なカテゴリーに分類することができる:有機溶媒ベースの組織透明化技術、水性試薬ベースの組織透明化技術、およびヒドロゲルベースの組織透明化技術17,19。ポリエチレングリコール(PEG)関連溶剤系(PEGASOS)が最近開発されました。このアプローチは、ほぼすべてのタイプの組織を透明にし、骨や歯などの硬組織を含む内因性蛍光を維持します20。PEGASOS法は、特に歯や骨の材料の除去において、他の組織透明化方法よりも優れています。他のほとんどの方法は、硬組織を部分的にしか除去できず、処理時間が長く、または高価な試薬を必要とする21。また、PEGASOS法は、他の方法よりも内因性蛍光を効率的に保存することができます。
この文献により、細胞研究のための新しい方法を作成しました。EdU標識のLRC検出の利点と、組織クリア標本の最も優れた3Dホールマウントイメージングを組み合わせました。サンプルは、高度なポリエチレングリコール(PEG)関連溶媒システム(PEGASOS)組織透明化技術15で処理されました。硬組織の透明性により、歯や下顎骨を壊すことなく、 in vivoで LRCの蛍光の3Dシグナルを再構築することができ、LRCをより正確に視覚化および定量する方法を作成しました。
この研究では、マウス切歯のLRCを視覚化するための革新的なガイドを提供します。マウス切歯幹細胞ニッチ内のLRCの位置と量を決定するために、3D視覚的アプローチを行いました。このプロジェクトでは、EdUラベリング、PEGASOS組織透明化技術、および共焦点顕微鏡を使用しました。ホールマウント組織上のLRCをEdU標識する方法と、透明で透明な標本を使用することで、従来の切片スライドの制限やその他の不利なDNA標識方法の両方を克服します。したがって、私たちの技術は、LRCの検出を必要とする幹細胞恒常性、特に硬組織の研究に適しています。このプロトコルは、他の組織や臓器における幹細胞の恒常性に焦点を当てている人にとっても同様に有利であり得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
複数回投与の注射(BrdU、EdU)は、通常、増殖細胞を可能な限り標識するために、成長中の新生児マウスに使用されます1、6、13。追跡期間は、組織の再生率に関する重要なステップと見なされます6,13。マウス切歯は毎月更新されます。この特性により、研究者は追跡期間を4週間以?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿を編集してくれたメーガン・K・ホルトに感謝します。この研究は、NIH / NIDCR助成金DE026461およびDE028345、およびテキサスA&M歯学部からXiaofang Wang博士へのスタートアップ資金によってサポートされました。
Materials
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
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