Rilevamento e quantificazione delle cellule che conservano l'etichetta negli incisivi di topo utilizzando un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia dei tessuti

Summary

L’incisivo del topo contiene preziose cellule che conservano l’etichetta nella sua nicchia di cellule staminali. Abbiamo un nuovo modo per rilevare e quantificare in modo imparziale le celle che conservano l’etichetta; il nostro studio ha utilizzato l’etichettatura EdU e un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia del tessuto PEGASOS della mandibola.

Abstract

L’incisivo murino è un organo che cresce continuamente per tutta la durata della vita del topo. Le cellule staminali epiteliali e mesenchimali che risiedono nei tessuti prossimali degli incisivi danno origine a progenie che si differenziano in ameloblasti, odontoblasti e fibroblasti della polpa. Queste cellule sono cruciali nel sostenere il turnover sostenuto dei tessuti incisivi, rendendo l’incisivo murino un modello eccellente per studiare l’omeostasi delle cellule staminali adulte. Si ritiene che le cellule staminali contengano cellule quiescenti di lunga durata che possono essere etichettate con analoghi nucleotidici come la 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU). Le cellule mantengono questa etichetta nel tempo e sono di conseguenza chiamate cellule di conservazione dell’etichetta (LRC). Gli approcci per la visualizzazione di LRC in vivo forniscono uno strumento robusto per il monitoraggio dell’omeostasi delle cellule staminali. In questo studio, abbiamo descritto un metodo per visualizzare e analizzare gli LRC. Il nostro approccio innovativo prevede LRC negli incisivi di topo dopo la pulizia dei tessuti e la colorazione EdU a montaggio completo, seguita da microscopia confocale e ricostruzione tridimensionale (3D) con il software di imaging. Questo metodo consente l’acquisizione di immagini 3D e la quantificazione non distorta rispetto all’analisi LRC tradizionale su vetrini sezionati.

Introduction

L’incisivo di topo in continua crescita è un modello eccellente per lo studio delle cellule staminali adulte¹. Le cellule staminali epiteliali (ansa cervicale labiale e linguale) e mesenchimali (tra l’ansa cervicale labiale e linguale) che risiedono sul lato prossimale dell’incisivo si differenziano in ameloblasti, odontoblasti e cellule polpa dentali. Questo processo unico fornisce una fonte di cellule per la compensazione della perdita di tessuto e del turnover². Anche se diversi marcatori di cellule staminali come Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, ecc. sono stati identificati in vivo per i sottogruppi di cellule staminali adulte negli incisivi di topo, sono inadeguati nel rappresentare le popolazioni di cellule staminali quando usati da soli 1,3,4,5. La visualizzazione di cellule quiescenti a lunga vita mediante marcatura e ritenzione del DNA analogico nucleotidico potrebbe fornire un rilevamento imparziale per la maggior parte dei sottogruppi di cellule staminali adulte⁶. Inoltre, questo approccio è utile tra molti metodi di identificazione delle cellule staminali⁷ per comprendere il comportamento cellulare e l’omeostasi delle popolazioni di cellule staminali dentali ^3,8. Mentre le cellule staminali in divisione perderebbero la loro etichettatura del DNA dopo un considerevole inseguimento, le presunte cellule staminali quiescenti mantengono la loro etichetta di DNA, ritenendole cellule che mantengono l’etichetta (LRC)⁶. L’etichettatura e la conservazione del DNA da parte di cellule staminali non in divisione segneranno e localizzeranno le cellule staminali adulte putative nelle loro nicchie.

Negli ultimi anni, l’analogo della timidina 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) ha sostituito l’ingombrante, dispendioso in termini di tempo e ad alta risoluzione incompatibile metodo di marcatura del DNA 3H-timidina per i saggi di proliferazione cellulare ^6,9. Negli ultimi anni, la tecnica di etichettatura della 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) è stata sempre più utilizzata su BrdU. Questo modello è emerso a causa di diversi motivi. In primo luogo, il metodo BrdU è lento e laborioso. Le condizioni dell’utente sono variabili e non è in grado di preservare l’ultrastruttura nei campioni (a causa della denaturazione del DNA). Allo stesso modo, il metodo BrdU perde l’antigenicità delle cellule, rendendolo così inefficiente per analisi funzionali a valle e saggi come gli esperimenti di co-localizzazione e il trapianto di cellule staminali in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU è anche un teratogeno, che non è adatto per etichettare LRC nello sviluppo embrionale⁶. Inoltre, il metodo BrdU è inefficiente se utilizzato nei campioni a montaggio intero. Gli svantaggi sono la bassa penetrazione degli anticorpi nella parte profonda dei campioni o la necessità di un lungo periodo di incubazione degli anticorpi per la penetrazione profonda¹³. L’etichettatura EdU sfugge alle fasi di denaturazione dei campioni, preservando così l’ultrastruttura. Questa caratteristica è vantaggiosa per le analisi funzionali a valle come esperimenti di co-localizzazione e trapianto di cellule staminali^11,12. Inoltre, l’etichettatura EdU è altamente sensibile e rapida; La penetrazione dei campioni è elevata grazie all’uso di azidi fluorescenti ad assorbimento rapido e di dimensioni più piccole per rilevare etichette EdU attraverso una reazione di cicloaddizione catalizzata da Cu(I) [3 + 2] (chimica a “clic”)¹⁴.

Un altro metodo di marcatura del DNA sempre più applicato è l’uso di topi transgenici ingegnerizzati. Questi topi esprimono la proteina fluorescente verde dell’istone 2B (H2B-GFP) controllata da un elemento regolatore sensibile alla tetraciclina ^5,14. Dopo aver alimentato i topi con tetraciclina chow/acqua per un periodo di inseguimento da 4 settimane a 4 mesi, la fluorescenza GFP diminuirà nelle cellule cicliche e solo gli LRC manterranno la fluorescenza⁶. Il vantaggio di questo metodo è che le LRC marcate possono essere isolate e rimanere vitali per la coltura cellulare o le analisi funzionali a valle ^6,7. Alcuni studi hanno riportato un’etichettatura imprecisa delle cellule staminali quiescenti quando inseguite per un uso a lungo termine. Questo risultato era dovuto a un’espressione di fondo permeabile dal ceppo H2B-GFP e non alla risposta appropriata regolata dalla tetraciclina¹⁵.

Inoltre, la maggior parte della letteratura in passato utilizzava il rilevamento degli LRC principalmente su vetrini sezionati, che sono bidimensionali e spesso erroneamente distorti nel mostrare la posizione accurata e il numero di LRC. L’approccio ha mostrato angoli errati per sezioni di strutture tissutali complesse¹⁶. L’altro metodo era quello di ottenere immagini 3D da sezioni seriali ed eseguire ricostruzioni post-immagine. Questi passaggi erano imprecisi a causa della distorsione dell’immagine dovuta alle variazioni in ogni sezione seriale a causa di sezioni compresse o allungate, con conseguente perdita di informazioni^16,17,18. Il metodo era anche laborioso e richiedeva molto tempo.

Per facilitare l’imaging completo degli LRC, i campioni devono essere chiari mentre la fluorescenza deve essere ben mantenuta. Le attuali tecniche di pulizia dei tessuti possono essere classificate in tre categorie principali: tecniche di pulizia dei tessuti a base di solventi organici, tecniche di pulizia dei tessuti a base di reagenti acquosi e tecniche di pulizia dei tessuti a base di idrogel^17,19. Il sistema solvente associato al glicole polietilenico (PEG) (PEGASOS) è stato recentemente sviluppato. Questo approccio rende trasparenti quasi tutti i tipi di tessuti e preserva la fluorescenza endogena, compresi i tessuti duri come ossa e denti²⁰. Il metodo PEGASOS presenta vantaggi rispetto ad altri metodi di pulizia dei tessuti, specialmente nella pulizia dei materiali dentali e ossei. La maggior parte degli altri metodi potrebbe eliminare solo parzialmente i tessuti duri, avere lunghi tempi di lavorazione o richiedere costosi reagenti²¹. Inoltre, il metodo PEGASOS può preservare efficacemente la fluorescenza endogena rispetto ad altri metodi.

Questa letteratura ci ha portato a creare un nuovo metodo per lo studio cellulare. Abbiamo combinato i vantaggi di rilevamento LRC dell’etichettatura EdU con l’imaging 3D a montaggio intero più superiore di campioni eliminati dai tessuti; i campioni sono stati elaborati con la tecnica di pulizia dei tessuti PEGASOS (Advanced Polyethylene Glycol (PEG)-associated solvent system (PEGASOS)¹⁵. La trasparenza dei tessuti duri ci ha permesso di ricostruire il segnale 3D della fluorescenza delle LRC in vivo senza rompere i denti o la mandibola, creando un modo più accurato per visualizzare e quantificare gli LRC.

In questo studio, forniamo una guida innovativa per visualizzare gli LRC nell’incisivo del topo. Abbiamo realizzato un approccio visivo 3D per determinare la posizione e la quantità di LRC all’interno della nicchia delle cellule staminali incisive del topo. Questo progetto ha utilizzato l’etichettatura EdU, le tecniche di eliminazione dei tessuti PEGASOS e la microscopia confocale. Il nostro metodo di marcatura EdU degli LRC su tessuto a montaggio intero e l’uso di un campione chiaro e trasparente supera sia i limiti dei tradizionali vetrini sezionati che altri metodi di etichettatura del DNA svantaggiosi. Pertanto, la nostra tecnica sarà adatta per studi sull’omeostasi delle cellule staminali che richiedono il rilevamento di LRC, in particolare sui tessuti duri. Il protocollo può essere ugualmente vantaggioso per coloro che si concentrano sull’omeostasi delle cellule staminali in altri tessuti e organi.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) per il Texas A & M University College of Dentistry. 1. Preparazione del cocktail di etichettatura EdU Preparare le soluzioni di cocktail come descritto nella tabella 1. Preparare il cocktail di etichettatura EdU come descritto nella Tabella 1. 2. Preparazione dei topi e della sol…

Representative Results

Dopo l’etichettatura EdU e il processo di eliminazione dei tessuti PEGASOS (Figura 2), la mandibola trasparente è stata ottenuta come mostrato nella nostra immagine (Figura 3B). Abbiamo confrontato il campione modificato con una mandibola normale senza un processo di pulizia dei tessuti (Figura 3A). La mandibola trasparente (Figura 3B) con etichettatura EdU è stata sottoposta a imaging confocale. Ci s…

Discussion

Dosi multiple di iniezioni (BrdU, EdU) sono solitamente utilizzate su topi neonatali in crescita per etichettare il più possibile le cellule proliferanti ^1,6,13. Il periodo di inseguimento è considerato un passo critico per quanto riguarda il tasso di rinnovamento dei tessuti ^6,13. L’incisivo del topo si rinnova circa ogni mese. Questa caratteristica consente ai ricerc…

Materials

0.5 M EDTA	Sigma Aldrcih	E9884
20 × Objective/NA 0.9	Leica	507702
50 mL Falcon Centrifuge Tubes	Falcon	352070
BD PrecisionGlide Needle	BD	REF 305111
Bezyl benzoate (BB)	Sigma Aldrcih	409529
Bitplane 9.0.1	Imaris
BRAND cavity slides	Millipore Sigma	BR475505
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Strain #:000664
Circulation Pump	VWR	23609-170
CuSO4	Sigma Aldrcih	451657
DMSO	Sigma Aldrcih	D8418
EdU	Carboynth	NE08701
Heparin	Miiilipore Sigma	H3149
Imaging System	Olympus	DP27
LAS X Software	Leica
Olympus Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Paraformaldehye	Sigma Aldrich	P6148
PBS	Sigma Aldrich	P4417
PEGMMA500	Sigma Aldrich	447943
Quadrol	Sigma Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma Aldrich	11140
Sulfa-Cyanine 3 Azide	Lumiprobe	D1330
TBS-10X	Cell Signaling Technology	12498
TCS SP8 Confocal Microscope	Leica
tert-butanol (tB)	Sigma Aldrich	360538
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100