我们提出了一种用于实现干涉反射显微镜和全内反射荧光显微镜的方案,用于动态微管和荧光标记的微管相关蛋白的同时成像。
已经采用了几种技术来直接可视化细胞骨架细丝及其相关蛋白质。全内反射荧光(TIRF)显微镜具有很高的信背景比,但它受到荧光蛋白的光漂白和光损伤。干涉反射显微镜(IRM)和干涉散射显微镜(iSCAT)等无标记技术可以避免光漂白问题,但不能轻易地可视化单个分子。本文提出了一种将IRM与商用TIRF显微镜相结合的方案,用于在体外同时对微管相关蛋白(MAPs)和动态微管进行成像。该协议允许高速观察与动态微管相互作用的MAP。这改进了现有的双色TIRF设置,既不需要微管标记,又不需要几个额外的光学元件,例如第二个激发激光器。两个通道在同一相机芯片上成像,以避免图像配准和帧同步问题。这种设置是通过可视化在动态微管上行走的单个驱动蛋白分子来证明的。
全内反射荧光(TIRF)显微镜通常用于单个荧光分子的可视化。与落射荧光成像相比,TIRF实现了出色的背景抑制,允许对单个荧光团进行高分辨率定位和跟踪。因此,TIRF是可视化荧光标记的微管相关蛋白的首选方法,并且经常用于对微管1,2进行成像。
为了研究MAP对微管动力学的调节,通常需要同时对微管和MAP进行成像。用于此目的的大多数现有方法都很昂贵或存在技术缺陷。例如,同时使用双色TIRF需要两个激励激光器和两个摄像头。除了高成本之外,对单独相机的需求还带来了帧同步和图像配准问题。如果使用旋转滤波立方体在连续帧3中的激发激光器之间进行物理切换,则可以避免这种需求。在这样的设置中,可以使用单个相机芯片,并且帧在微管和MAP的图像之间交替。但是,此技术受滤镜更改速度的限制,这通常会将帧速率限制为小于 0.5 帧/秒3 (fps)。这样的帧速率不足以解决快速动态过程,例如以高达500 nm / s的速度发生的微管收缩,运动蛋白以大约800 nm / s的速度行走,或以超过0.3μm2 / s4的速度发生的MAP的扩散。当跟踪每个通道中两个移动目标的相对位置时,这尤其成问题,例如MAP相对于移动微管尖端5的位置。
除了这些光学限制之外,双色TIRF显微镜还要求MAPs和微管用不同的荧光团标记,其发射光谱充分分离。微管蛋白的荧光标记可以改变微管动力学6,荧光团的光漂白限制了成像速度7。由于这些问题,已经开发了无标记成像技术来可视化微管。其中包括干涉散射显微镜(iSCAT)8,9,旋转相干散射显微镜(ROCS)10,空间光干涉显微镜(SLIM)11和干涉反射显微镜(IRM)12,13。这些技术允许微管的快速无标记成像,而没有荧光成像的缺点,但它们不能用于可视化单个MAP。
在这些无标签技术中,IRM 以其低成本和对仪器的适度要求而著称。我们最近提出了一种将IRM与商用TIRF显微镜相结合的方案,允许在交替的帧3,13中对微管和荧光MAP进行成像。本文介绍了一种用于修改此设置的协议,以便在单个相机芯片上同时捕获TIRF和IRM图像。这涉及在激发路径中添加一个廉价的分束器,以同时用TIRF激光器和IRM LED光源照亮样品。改进的商用图像分配器用于以光谱方式分离TIRF和IRM信号,并将它们投影到同一相机芯片的单独一半上。我们还采用微流体系统,允许在成像过程中快速交换试剂。该协议描述了如何使用此设置对动态微管和MAP进行成像。通过呈现在收缩的微管上行走的驱动蛋白-1蛋白的第一次可视化来证明该装置的能力,该微管以10 s-1的帧速率捕获。
研究微管相关蛋白(MAP)对微管动力学的调节通常需要同时对微管和MAP进行成像。荧光显微镜技术(如TIRF)通常用于此目的。然而,它们受到荧光成像缺点的限制,其中包括光漂白,光损伤和对荧光团标记的需求。无标记方法(如 IRM)适用于微管的可视化,但不能对单个荧光团进行成像。该协议结合了无标记的IRM成像和TIRF显微镜,可同时对动态微管和MAP进行成像。
IRM 设置采用滤波至 >600 nm 的 LED 照明源,而 TIRF 设置采用 488 nm 激光器。我们使用廉价的板式分束器将照明光反射到样品上,并将收集的信号传输到检测器(图1)。选择具有10%反射率和90%透射率的分束器,以最大限度地减少单分子信号的损失。通过增加照明激光器和LED的功率来补偿照明光强度的90%损失。
使用90/10(R/T)分束器和两个光谱滤波器(IRM为长通600 nm,TIRF为带通535/50 nm)实现了信号的频谱分离。光谱分离的IRM和TIRF信号使用图像分配器组件投射到单个相机芯片的两半上。使用90/10分束器会牺牲90%的IRM信号,但这可以通过增加LED照明源的强度来补偿。这里还可以使用二向色镜来更有效地分离IRM和TIRF信号。检测中包含的荧光微珠能够精确对准TIRF和IRM图像,并作为聚焦物镜的参考。
该协议中最关键的光学元件是高数值孔径(NA)物镜。这不仅对于实现全内反射至关重要,而且对于最大限度地提高收集效率和图像对比度也至关重要。获得的图像的质量还取决于玻璃表面的清洁度和获得清晰的背景图像,以校正不均匀的照明并消除静态特征。对于 IRM 成像,我们建议使用长波长照明 (>600 nm) 以最大限度地减少微管和蛋白质的光损伤。如果使用白色LED光源,这一点尤其重要,在这种情况下,应包括长通滤光片以去除任何紫外线。
该协议允许对动态微管进行无标记,高速成像,并同时对荧光MAPs17进行高分辨率可视化。与在捕获微管和MAP图像之间交替的滤波立方体切换技术相比,此设置能够实现更高的帧速率,因为它不依赖于滤波立方体的物理旋转。与双色TIRF成像技术相比,该技术采用的光学设置要求较低,并且无需对微管的荧光团标记。此设置的主要限制是由于MAP的TIRF成像;帧速率受荧光团曝光时间的限制,荧光团的光漂白仍然是可能的。尽管如此,该协议改进了现有技术,因为它仅在必要时使用TIRF(即可视化MAP而不是微管),并在TIRF的范围内实现最高速度。只有当微管和MAPs都通过干涉技术可视化时,才有可能进一步改进,但这需要用金属纳米颗粒标记MAP,这有其局限性和实验挑战。
为了证明这项技术的能力,我们通过IRM和TIRF同时可视化了两个快速动力学过程:微管的收缩和荧光驱动蛋白分子的行走。该技术以前已被用于可视化痉挛素在收缩的微管上的快速扩散5。除了应用于MAPs和微管之外,该协议还可用于同时可视化单个荧光分子,其质量足以通过IRM可视化的任何大分子结构,例如细胞膜或肌动蛋白丝。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Thierry Emonet的实验室共享洁净室设备。我们感谢郭银伟制备了本研究中使用的纯化eGFP-驱动蛋白。Y.T.感谢亚历山大·冯·洪堡基金会通过费奥多尔·林宁研究奖学金提供的支持。这项工作得到了NIH Grant R01 GM139337(给J.H.)的支持。
10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |