We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.
Verschillende technieken zijn gebruikt voor de directe visualisatie van cytoskeletale filamenten en de bijbehorende eiwitten. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopie heeft een hoge signaal-achtergrondverhouding, maar lijdt aan fotobleaching en fotoschade van de fluorescerende eiwitten. Labelvrije technieken zoals interferentiereflectiemicroscopie (IRM) en interferometrische verstrooiingsmicroscopie (iSCAT) omzeilen het probleem van fotobleaching, maar kunnen afzonderlijke moleculen niet gemakkelijk visualiseren. Dit artikel presenteert een protocol voor het combineren van IRM met een commerciële TIRF-microscoop voor de gelijktijdige beeldvorming van microtubule-geassocieerde eiwitten (MAPs) en dynamische microtubuli in vitro. Dit protocol maakt snelle observatie mogelijk van MAPs die interageren met dynamische microtubuli. Dit verbetert bestaande tweekleurige TIRF-opstellingen door zowel de noodzaak van microtubule-etikettering als de noodzaak van verschillende extra optische componenten, zoals een tweede excitatielaser, te elimineren. Beide kanalen worden op dezelfde camerachip weergegeven om problemen met beeldregistratie en framesynchronisatie te voorkomen. Deze opstelling wordt gedemonstreerd door het visualiseren van enkele kinesinemoleculen die op dynamische microtubuli lopen.
Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopie wordt vaak gebruikt voor de visualisatie van enkele fluorescerende moleculen. In vergelijking met epifluorescentiebeeldvorming bereikt TIRF superieure achtergrondonderdrukking, waardoor lokalisatie met hoge resolutie en tracking van enkele fluoroforen mogelijk is. Om deze reden is TIRF de voorkeursmethode voor het visualiseren van fluorescerend gelabelde microtubule-geassocieerde eiwitten en wordt het vaak gebruikt om microtubuli in beeld te brengen 1,2.
Om de regulatie van microtubuledynamica door MAPs te onderzoeken, is het vaak nodig om zowel microtubuli als MAPs tegelijkertijd in beeld te brengen. De meeste bestaande methoden voor dit doel zijn duur of lijden aan technische nadelen. Simultane tweekleurige TIRF vereist bijvoorbeeld twee excitatielasers en twee camera’s. Naast de hoge kosten levert de behoefte aan aparte camera’s framesynchronisatie en beeldregistratieproblemen op. Deze behoefte kan worden omzeild als een roterende filterkubus wordt gebruikt om fysiek te schakelen tussen excitatielasers in opeenvolgende frames3. In zo’n opstelling kan een enkele camerachip worden gebruikt en wisselen de frames af tussen beelden van microtubuli en MAPs. Deze techniek wordt echter beperkt door de snelheid van de filterwissel, die de framesnelheid doorgaans beperkt tot minder dan 0,5 frames per seconde3 (fps). Een dergelijke framesnelheid is onvoldoende om snelle dynamische processen op te lossen, zoals de krimp van een microtubuli met een snelheid tot 500 nm/s, het lopen van een kinesine met een snelheid in de orde van grootte van 800 nm/s, of de diffusie van een MAP die optreedt met diffusiecoëfficiënten van meer dan 0,3 μm2/s4. Dit is met name problematisch bij het volgen van de relatieve posities van twee bewegende doelen in elk kanaal, zoals de positie van een MAP ten opzichte van de positie van een bewegende microtubule tip5.
Naast deze optische beperkingen vereist tweekleurige TIRF-microscopie dat MAPs en microtubuli worden gelabeld met verschillende fluoroforen waarvan de emissiespectra voldoende gescheiden zijn. Fluorescerende etikettering van tubuline kan de microtubule-dynamiek6 veranderen en het fotobleachen van fluoroforen beperkt de beeldvormingssnelheid7. Vanwege deze problemen zijn labelvrije beeldvormingstechnieken ontwikkeld om microtubuli te visualiseren. Deze omvatten interferometrische verstrooiingsmicroscopie (iSCAT)8,9, rotating-coherent-scattering microscopie (ROCS)10, spatial light interference microscopy (SLIM)11 en interference reflection microscopy (IRM)12,13. Deze technieken maken snelle labelvrije beeldvorming van microtubuli mogelijk zonder de nadelen van fluorescentiebeeldvorming, maar ze kunnen niet worden gebruikt om afzonderlijke MAPs te visualiseren.
Van deze labelvrije technieken onderscheidt IRM zich door zijn lage kosten en zijn bescheiden eisen aan instrumentatie. We hebben onlangs een protocol gepresenteerd voor het combineren van IRM met een commerciële TIRF-microscoop, waardoor microtubuli en fluorescerende MAPs in afwisselende frames kunnen worden afgebeeld 3,13. Dit artikel presenteert een protocol voor het wijzigen van deze opstelling om tegelijkertijd TIRF- en IRM-beelden vast te leggen op een enkele camerachip. Dit omvat de toevoeging van een goedkope bundelsplitser in het excitatiepad om het monster tegelijkertijd te verlichten met een TIRF-laser en een IRM LED-lichtbron. Een gemodificeerde commerciële beeldsplitter wordt gebruikt om de TIRF- en IRM-signalen spectraal te scheiden en te projecteren op afzonderlijke helften van dezelfde camerachip. We maken ook gebruik van een microfluïdisch systeem dat de snelle uitwisseling van reagentia tijdens beeldvorming mogelijk maakt. Dit protocol beschrijft hoe deze opstelling kan worden gebruikt om dynamische microtubuli en MAPs in beeld te brengen. Het vermogen van het apparaat wordt gedemonstreerd door de eerste visualisatie van kinesine-1-eiwitten te presenteren die op krimpende microtubuli lopen, die wordt vastgelegd met een framesnelheid van 10 s-1.
Het bestuderen van de regulatie van microtubule-dynamica door microtubule-geassocieerde eiwitten (MAPs) vereist vaak gelijktijdige beeldvorming van microtubuli en MAPs. Fluorescentiemicroscopietechnieken zoals TIRF worden meestal voor dit doel gebruikt. Ze worden echter beperkt door de nadelen van fluorescentiebeeldvorming, waaronder fotobleaching, fotoschade en de noodzaak van fluorofooretikettering. Labelvrije methoden, zoals IRM, zijn geschikt voor het visualiseren van microtubuli, maar zijn niet in staat om afzonderlijke fluoroforen in beeld te brengen. Dit protocol combineert labelvrije IRM-beeldvorming en TIRF-microscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en MAPs.
De IRM-opstelling maakt gebruik van een LED-verlichtingsbron gefilterd tot >600 nm, terwijl de TIRF-opstelling een 488 nm-laser gebruikt. We gebruikten een goedkope plaatbundelsplitter om het verlichtingslicht op het monster te reflecteren en het verzamelde signaal naar de detector te sturen (figuur 1). Een bundelsplitser met 10% reflectie en 90% transmissie werd gekozen om het verlies van het signaal met één molecuul te minimaliseren. Het verlies van 90% in de lichtintensiteit van de verlichting wordt gecompenseerd door het vermogen van de verlichtingslaser en LED te verhogen.
Spectrale scheiding van de signalen werd bereikt met behulp van een 90/10 (R/T) bundelsplitser en twee spectrale filters (long-pass 600 nm voor IRM en band-pass 535/50 nm voor TIRF). De spectraal gescheiden IRM- en TIRF-signalen worden geprojecteerd op twee helften van een enkele camerachip met behulp van een beeldsplitserassemblage. Het gebruik van een 90/10 beam splitter offert 90% van het IRM-signaal op, maar dit wordt gecompenseerd door de intensiteit van de LED-verlichtingsbron te verhogen. Een dichroïsche spiegel zou hier ook kunnen worden gebruikt om de IRM- en TIRF-signalen efficiënter te scheiden. Fluorescerende microbeads die in de assays zijn opgenomen, maken een nauwkeurige uitlijning van de TIRF- en IRM-beelden mogelijk en dienen als referentie voor het scherpstellen van het doel.
Het meest kritische optische element in dit protocol is het hoge numerieke diafragma (NA) objectief. Dit is niet alleen essentieel om totale interne reflectie te bereiken, maar ook om de efficiëntie van de collectie en het beeldcontrast te maximaliseren. De kwaliteit van de verkregen afbeeldingen hangt ook af van de netheid van het glasoppervlak en de verwerving van een duidelijke achtergrondafbeelding om te corrigeren voor niet-uniforme verlichting en statische kenmerken te verwijderen. Voor IRM-beeldvorming raden we aan om verlichting met een lange golflengte (>600 nm) te gebruiken om de fotoschade van microtubuli en eiwitten te minimaliseren. Dit is vooral belangrijk als een witte LED-lichtbron wordt gebruikt, in welk geval een long-pass filter moet worden meegeleverd om UV-licht te verwijderen.
Dit protocol maakt labelvrije, snelle beeldvorming van dynamische microtubuli en gelijktijdige hoge-resolutie visualisatie van fluorescerende MAPs17 mogelijk. Vergeleken met de filterkubusschakeltechniek, die afwisselt tussen het vastleggen van afbeeldingen van microtubuli en MAPs, is deze opstelling in staat tot veel hogere framesnelheden omdat deze niet afhankelijk is van de fysieke rotatie van een filterkubus. In vergelijking met tweekleurige TIRF-beeldvormingstechnieken maakt deze techniek gebruik van een minder veeleisende optische opstelling en omzeilt de noodzaak van fluorofooretikettering van microtubuli. De primaire beperkingen van deze opstelling zijn te wijten aan de TIRF-beeldvorming van de MAPs; de framesnelheid wordt beperkt door de belichtingstijd van een fluorofoor en fotobleaching van fluoroforen blijft een mogelijkheid. Niettemin verbetert dit protocol de bestaande technieken omdat het TIRF alleen gebruikt wanneer dat nodig is (d.w.z. om MAPs te visualiseren, maar geen microtubuli) en de hoogst mogelijke snelheid bereikt binnen de grenzen van TIRF. Verdere verbeteringen zijn alleen mogelijk als zowel de microtubuli als de MAPs worden gevisualiseerd via een interferometrische techniek, maar dit vereist het labelen van MAPs met metalen nanodeeltjes, wat zijn beperkingen en experimentele uitdagingen heeft.
Om de mogelijkheden van deze techniek te demonstreren, hebben we tegelijkertijd twee snelle dynamische processen gevisualiseerd via IRM en TIRF: de krimp van een microtubuli en het lopen van een fluorescerend kinesinemolecuul. Deze techniek is eerder gebruikt om de snelle diffusie van spastine op krimpende microtubuli te visualiseren5. Naast deze toepassing op MAPs en microtubuli, kan dit protocol worden gebruikt om enkele fluorescerende moleculen tegelijkertijd te visualiseren met elke macromoleculaire structuur die massief genoeg is om te worden gevisualiseerd via IRM, zoals een celmembraan of actinefilament.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken het lab van Thierry Emonet voor het delen van cleanroomapparatuur. We danken Yin-Wei Kuo voor het voorbereiden van de gezuiverde eGFP-kinesine die in deze studie wordt gebruikt. Y.T. erkent de steun van de Alexander von Humboldt Foundation via de Feodor Lynen Research Fellowship. Dit werk werd ondersteund door NIH Grant R01 GM139337 (aan J.H.).
10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |