हम गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन के एक साथ इमेजिंग के लिए हस्तक्षेप-प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी और कुल-आंतरिक-प्रतिबिंब-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स और उनके संबंधित प्रोटीन के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया गया है। कुल-आंतरिक-प्रतिबिंब-प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी में एक उच्च सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात होता है, लेकिन यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन के फोटोब्लीचिंग और फोटोडैमेज से ग्रस्त है। लेबल-मुक्त तकनीकें जैसे कि हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (आईआरएम) और इंटरफेरोमेट्रिक स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी (आईएससीएटी) फोटोब्लीचिंग की समस्या को दरकिनार करती हैं, लेकिन आसानी से एकल अणुओं की कल्पना नहीं कर सकती हैं। यह पेपर सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन (एमएपी) और विट्रो में गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं की एक साथ इमेजिंग के लिए एक वाणिज्यिक टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के साथ आईआरएम के संयोजन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं के साथ बातचीत करने वाले एमएपी के उच्च गति के अवलोकन की अनुमति देता है। यह सूक्ष्मनलिका लेबलिंग की आवश्यकता और कई अतिरिक्त ऑप्टिकल घटकों की आवश्यकता, जैसे कि दूसरे उत्तेजना लेजर की आवश्यकता को समाप्त करके मौजूदा दो-रंग टीआईआरएफ सेटअप पर सुधार करता है। दोनों चैनलों को छवि पंजीकरण और फ्रेम सिंक्रनाइज़ेशन समस्याओं से बचने के लिए एक ही कैमरा चिप पर चित्रित किया जाता है। इस सेटअप को गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं पर चलने वाले एकल किनेसिन अणुओं की कल्पना करके प्रदर्शित किया जाता है।
कुल-आंतरिक-प्रतिबिंब-प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी आमतौर पर एकल फ्लोरोसेंट अणुओं के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए नियोजित होती है। एपिफ्लोरेसेंस इमेजिंग की तुलना में, टीआईआरएफ बेहतर पृष्ठभूमि दमन प्राप्त करता है, जिससे उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्थानीयकरण और एकल फ्लोरोफोरस की ट्रैकिंग की अनुमति मिलती है। इस कारण से, TIRF फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन की कल्पना करने के लिए पसंदीदा विधि है और अक्सर सूक्ष्मनलिकाएं 1,2 की छवि के लिए उपयोग किया जाता है।
एमएपी द्वारा सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता के विनियमन की जांच करने के लिए, अक्सर सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी दोनों को एक साथ प्रतिबिंबित करना आवश्यक होता है। इस उद्देश्य के लिए अधिकांश मौजूदा तरीके महंगे हैं या तकनीकी कमियों से पीड़ित हैं। उदाहरण के लिए, एक साथ दो रंग के टीआईआरएफ को दो उत्तेजना लेजर और दो कैमरों की आवश्यकता होती है। उच्च लागत के अलावा, अलग-अलग कैमरों की आवश्यकता फ्रेम-सिंक्रनाइज़ेशन और छवि-पंजीकरण समस्याओं को जन्म देती है। इस आवश्यकता को दरकिनार किया जा सकता है यदि एक घूर्णन फ़िल्टर क्यूब का उपयोग लगातार फ्रेम3 में उत्तेजना लेजर के बीच शारीरिक रूप से स्विच करने के लिए किया जाता है। इस तरह के सेटअप में, एक एकल कैमरा चिप का उपयोग किया जा सकता है, और फ्रेम सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी की छवियों के बीच वैकल्पिक होते हैं। हालांकि, यह तकनीक फ़िल्टर परिवर्तन की गति से सीमित है, जो आमतौर पर फ्रेम दर को 0.5 फ्रेम प्रति सेकंड3 (एफपीएस) से कम तक सीमित करती है। इस तरह की फ्रेम दर तेजी से गतिशील प्रक्रियाओं को हल करने के लिए अपर्याप्त है, जैसे कि 500 एनएम / सेकंड तक के वेग पर होने वाली सूक्ष्मनलिकाएं का संकोचन, 800 एनएम / एस के क्रम पर वेग पर एक किनेसिन का चलना, या 0.3 μm2 / s4 से अधिक प्रसार गुणांक के साथ होने वाले एमएपी का प्रसार। प्रत्येक चैनल में दो चलती लक्ष्यों के सापेक्ष पदों को ट्रैक करते समय यह विशेष रूप से समस्याग्रस्त है, जैसे कि एक चलती सूक्ष्मनलिकाएं टिप5 की स्थिति के सापेक्ष एक एमएपी की स्थिति।
इन ऑप्टिकल बाधाओं के अलावा, दो-रंग टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी को एमएपी और सूक्ष्मनलिकाएं को विभिन्न फ्लोरोफोर के साथ लेबल करने की आवश्यकता होती है जिनके उत्सर्जन स्पेक्ट्रा पर्याप्त रूप से अलग होते हैं। ट्यूबुलिन की फ्लोरोसेंट लेबलिंग सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता6 को बदल सकती है, और फ्लोरोफोरस की फोटोब्लीचिंग इमेजिंग गति7 को सीमित करती है। इन मुद्दों के कारण, सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना करने के लिए लेबल-मुक्त इमेजिंग तकनीकों को विकसित किया गया है। इनमें इंटरफेरोमेट्रिक स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी (iSCAT) 8,9, घूर्णन-सुसंगत-प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी (ROCS)10, स्थानिक प्रकाश हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी (SLIM)11, और हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (IRM)12,13 शामिल हैं। ये तकनीकें प्रतिदीप्ति इमेजिंग की कमियों के बिना सूक्ष्मनलिकाएं के तेजी से लेबल-मुक्त इमेजिंग की अनुमति देती हैं, लेकिन उनका उपयोग एकल एमएपी की कल्पना करने के लिए नहीं किया जा सकता है।
इन लेबल-मुक्त तकनीकों में से, आईआरएम अपनी कम लागत और इंस्ट्रूमेंटेशन पर अपनी मामूली मांगों के लिए खड़ा है। हमने हाल ही में एक वाणिज्यिक टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के साथ आईआरएम के संयोजन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है, जिससे सूक्ष्मनलिकाएं और फ्लोरोसेंट एमएपी को बारी-बारी से फ्रेम3,13 में चित्रित किया जा सकता है। यह पेपर एक ही कैमरा चिप पर एक साथ TIRF और IRM छवियों को कैप्चर करने के लिए इस सेटअप को संशोधित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इसमें उत्तेजना पथ में एक सस्ती बीम विभाजक के अलावा एक साथ एक TIRF लेजर और एक आईआरएम एलईडी प्रकाश स्रोत के साथ नमूने को रोशन करने के लिए शामिल है। एक संशोधित वाणिज्यिक छवि विभाजक का उपयोग टीआईआरएफ और आईआरएम संकेतों को वर्णक्रमीय रूप से अलग करने और उन्हें एक ही कैमरा चिप के अलग-अलग हिस्सों पर प्रोजेक्ट करने के लिए किया जाता है। हम एक माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम को भी नियोजित करते हैं जो इमेजिंग के दौरान अभिकर्मकों के तेजी से आदान-प्रदान की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि इस सेटअप का उपयोग गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी की छवि के लिए कैसे किया जा सकता है। उपकरण की क्षमता को सिकुड़ते हुए सूक्ष्मनलिकाएं पर चलने वाले किनेसिन -1 प्रोटीन के पहले विज़ुअलाइज़ेशन को प्रस्तुत करके प्रदर्शित किया जाता है, जिसे 10 एस –1 की फ्रेम दर पर कब्जा कर लिया जाता है।
सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन (एमएपी) द्वारा सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता के विनियमन का अध्ययन करने के लिए अक्सर सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी की एक साथ इमेजिंग की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक जैसे कि टीआईआरएफ आमतौर पर इस उद्देश्य के लिए नियोजित होते हैं। हालांकि, वे प्रतिदीप्ति इमेजिंग की कमियों से सीमित हैं, जिसमें फोटोब्लीचिंग, फोटोडैमेज और फ्लोरोफोर लेबलिंग की आवश्यकता शामिल है। लेबल-मुक्त तरीके, जैसे कि आईआरएम, सूक्ष्मनलिकाएं देखने के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन एकल फ्लोरोफोरस को इमेजिंग करने में सक्षम नहीं हैं। यह प्रोटोकॉल गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी की एक साथ इमेजिंग के लिए लेबल-मुक्त आईआरएम इमेजिंग और टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी को जोड़ता है।
आईआरएम सेटअप >600 एनएम पर फ़िल्टर किए गए एक एलईडी रोशनी स्रोत को नियोजित करता है, जबकि टीआईआरएफ सेटअप 488 एनएम लेजर का उपयोग करता है। हमने नमूने पर रोशनी प्रकाश को प्रतिबिंबित करने और एकत्र किए गए सिग्नल को डिटेक्टर (चित्रा 1) तक पहुंचाने के लिए एक सस्ती प्लेट बीम स्प्लिटर का उपयोग किया। एकल-अणु संकेत के नुकसान को कम करने के लिए 10% परावर्तकता और 90% संचरण के साथ एक बीम विभाजक चुना गया था। रोशनी प्रकाश तीव्रता में 90% नुकसान रोशनी लेजर और एलईडी की शक्ति में वृद्धि के लिए क्षतिपूर्ति की है।
संकेतों का वर्णक्रमीय पृथक्करण 90/10 (आर / टी) बीम स्प्लिटर और दो वर्णक्रमीय फिल्टर (आईआरएम के लिए 600 एनएम और टीआईआरएफ के लिए बैंड-पास 535/50 एनएम) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। वर्णक्रमीय रूप से अलग किए गए आईआरएम और टीआईआरएफ संकेतों को एक छवि विभाजक असेंबली का उपयोग करके एक एकल कैमरा चिप के दो हिस्सों पर प्रक्षेपित किया जाता है। 90/10 बीम विभाजक का उपयोग आईआरएम सिग्नल का 90% बलिदान करता है, लेकिन यह एलईडी रोशनी स्रोत की तीव्रता को बढ़ाकर मुआवजा दिया जाता है। आईआरएम और टीआईआरएफ संकेतों को अधिक कुशलता से अलग करने के लिए यहां एक डाइक्रोइक दर्पण का भी उपयोग किया जा सकता है। assays में शामिल फ्लोरोसेंट microbeads TIRF और IRM छवियों के सटीक संरेखण को सक्षम करते हैं और उद्देश्य पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक संदर्भ के रूप में सेवा करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण ऑप्टिकल तत्व उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य है। यह न केवल कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, बल्कि संग्रह दक्षता और छवि विपरीत को अधिकतम करने के लिए भी आवश्यक है। प्राप्त छवियों की गुणवत्ता भी कांच की सतह की स्वच्छता और nonuniform रोशनी के लिए सही करने के लिए एक स्पष्ट पृष्ठभूमि छवि के अधिग्रहण और स्थिर सुविधाओं को हटाने पर निर्भर करता है। आईआरएम इमेजिंग के लिए, हम सूक्ष्मनलिकाएं और प्रोटीन के फोटोडैमेज को कम करने के लिए लंबी तरंग दैर्ध्य रोशनी (>600 एनएम) का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि एक सफेद एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग किया जाता है, तो इस मामले में किसी भी यूवी प्रकाश को हटाने के लिए एक लॉन्ग-पास फ़िल्टर को शामिल किया जाना चाहिए।
यह प्रोटोकॉल लेबल-मुक्त, गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं की उच्च गति इमेजिंग और फ्लोरोसेंट एमएपी17 के एक साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। फिल्टर क्यूब स्विचिंग तकनीक की तुलना में, जो सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी की छवियों को कैप्चर करने के बीच वैकल्पिक है, यह सेटअप बहुत अधिक फ्रेम दरों में सक्षम है क्योंकि यह फ़िल्टर क्यूब के भौतिक रोटेशन पर निर्भर नहीं करता है। दो-रंग टीआईआरएफ इमेजिंग तकनीकों की तुलना में, यह तकनीक कम मांग वाले ऑप्टिकल सेटअप को नियोजित करती है और सूक्ष्मनलिकाएं के फ्लोरोफोर लेबलिंग की आवश्यकता को दरकिनार करती है। इस सेटअप की प्राथमिक सीमाएं एमएपी के टीआईआरएफ इमेजिंग के कारण हैं; फ्रेम दर एक fluorophore के जोखिम समय से सीमित है, और fluorophores के photobleaching एक संभावना बनी हुई है. फिर भी, यह प्रोटोकॉल मौजूदा तकनीकों पर सुधार करता है क्योंकि यह केवल आवश्यक होने पर टीआईआरएफ का उपयोग करता है (यानी, एमएपी की कल्पना करने के लिए लेकिन सूक्ष्मनलिकाएं नहीं) और टीआईआरएफ की सीमाओं के भीतर उच्चतम संभव गति प्राप्त करता है। आगे के सुधार केवल तभी संभव हैं जब सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी दोनों को एक इंटरफेरोमेट्रिक तकनीक के माध्यम से कल्पना की जाती है, लेकिन इसके लिए धातु नैनोकणों के साथ एमएपी को लेबल करने की आवश्यकता होती है, जिसकी अपनी सीमाएं और प्रयोगात्मक चुनौतियां हैं।
इस तकनीक की क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए, हमने एक साथ आईआरएम और टीआईआरएफ के माध्यम से दो तेज गतिकीय प्रक्रियाओं की कल्पना की: एक सूक्ष्मनलिकाएं का संकोचन और एक फ्लोरोसेंट किनेसिन अणु का चलना। इस तकनीक को पहले सिकुड़ने वाले सूक्ष्मनलिकाएं 5 पर स्पास्टिन के तेजी से प्रसार की कल्पना करने के लिए नियोजित किया गयाहै। एमएपी और सूक्ष्मनलिकाएं के लिए इस आवेदन से परे, इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी मैक्रोमोलेक्यूलर संरचना के साथ-साथ एकल फ्लोरोसेंट अणुओं को कल्पना करने के लिए किया जा सकता है, जो आईआरएम के माध्यम से कल्पना करने के लिए पर्याप्त है, जैसे कि सेल झिल्ली या एक्टिन फिलामेंट।
The authors have nothing to disclose.
हम Cleanroom उपकरणों को साझा करने के लिए Thierry Emonet की प्रयोगशाला को धन्यवाद देते हैं। हम इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले शुद्ध ईजीएफपी-किनेसिन को तैयार करने के लिए यिन-वेई कुओ को धन्यवाद देते हैं। Y.T. Feodor Lynen अनुसंधान फैलोशिप के माध्यम से अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन के समर्थन को स्वीकार करता है। यह काम NIH अनुदान R01 GM139337 (J.H. के लिए) द्वारा समर्थित था।
10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |